宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，也是妇女因癌症死亡的主要原因，尤其是在发展指数较低的国家。尽管人类乳头瘤病毒（HPV）已被确定为宫颈癌的主要病因，而且全世界都在努力通过接种 HPV 疫苗和早期筛查来根除这一疾病，但每年仍有大量患者被确诊。宫颈鳞状细胞癌（CSCC）是宫颈癌的主要组织类型，占宫颈癌总数的70%以上。手术、放疗和综合化疗对患者的治愈效果有限，而且往往有明显的副作用和并发症风险，因此精确的药物治疗难以实现。研究中常用的癌细胞系和肿瘤组织异种移植模型由于缺乏人体宫颈组织的特异性微环境，无法在体外准确复制人类 CSCC 的原生病理状态。因此，在体外再现肿瘤的发生仍然具有挑战性。因此，这些局限性阻碍了药物开发试验和精准医疗的实现。
来自华南理工大学的Hao Huang团队、来自复旦大学的林鑫华团队与来自南方医科大学的Yifeng Wang和Xiao Yi团队 合作收集了确诊为CSCC患者的癌旁宫颈组织，并制备了子宫颈细胞外基质（UCEM）水凝胶 。对 UCEM 进行的蛋白质组分析确定了几种组织特异性信号通路，包括人类乳头瘤病毒、磷脂酰肌醇3-激酶-AKT和细胞外基质受体。分泌蛋白如FLNA、MYH9、HSPA8和EEF1A1都存在，这表明UCEM成功地保持了宫颈蛋白。UCEM为CSCC器官组织提供了量身定制的微环境，使其在形成和生长的同时保留了致瘤潜能。RNA测序显示，UCEM-有机体与原生CSCC有更大的相似性，并反映出肿瘤的异质性，表现出与CSCC相关的信号通路，包括病毒蛋白-细胞因子、核因子κB、肿瘤坏死因子以及癌基因EGR1、FPR1和IFI6。此外，UCEM有机体对化疗产生了抗药性。本研究为通过原生基质水凝胶开发先进的类器官技术提供了启示。相关工作以题为“Cervical extracellular matrix hydrogel optimizes tumor heterogeneity of cervical squamous cell carcinoma organoids”的文章发表在2024年05月15日的国际顶级期刊《Science Advances》。
1.创新型研究内容
本研究收集了确诊为CSCC患者的癌旁宫颈组织，并用它制备了子宫颈ECM（UCEM）水凝胶。UCEM表现出宫颈组织特有的蛋白质组学特征，保留了宫颈 ECM的结构成分以及与癌变相关的信号通路和分泌蛋白。实验结果表明，UCEM 诱导的CSCC有机体的转录特征与患者的原生CSCC组织非常相似，保留了更多与CSCC相关的癌基因和信号通路。事实证明，这种与原生CSCC的相似性有利于捕捉CSCC的肿瘤异质性（图1）。
图1 利用UCEM水凝胶构建CSCC有机体可体现肿瘤的异质性
2.宫颈癌旁组织的脱细胞和凝胶化
本研究采用脱细胞技术制备了人子宫颈ECM水凝胶。根据本研究团队之前的报告，宫颈组织被切碎并脱细胞，然后进行灭菌、冻干和研磨成粉末。用盐酸胃蛋白酶消化后得到预凝胶。用氢氧化钠中和后得到UCEM（图 2A）。合成的UCEM透明度高，杂质少。在37℃孵育20至30分钟后，它们凝固成半球形液滴状结构，为细胞生长提供了可靠的环境。通过苏木精和H&E染色、Masson 染色和免疫荧光分析表明，脱细胞后大部分细胞成分（CCs）被去除，同时保留了重要的 ECM 成分，如I型和IV型胶原纤维、层粘连蛋白β1和纤连蛋白（图2B）。DNA含量定量显示，脱细胞前宫颈组织中的DNA含量为4048.34±270.72ng/mg，脱细胞后则为20.78±4.98 ng/mg，表明脱细胞后DNA含量显著减少（图2C）。此外，与新鲜的原生组织相比，脱细胞宫颈的干重明显减少（图2D）。脱细胞处理导致完整细胞和细胞核的去除，从而消除了大部分 CC。对 UCEM 微观结构的进一步研究表明，胶原纤维交联形成了致密的网络（图2E）。在37℃时，UCEM 的储存模量（G′）高于损耗模量（G″），表明成功形成了具有高粘弹性和机械强度的稳定ECM网络。这些发现表明，在成功去除细胞成分的同时，还保留了ECM的关键结构成分，从而形成了相对完整的ECM形态。
图2 通过脱细胞法制备人宫颈源性细胞外基质水凝胶（UCEM）
3.UCEM保存独特的宫颈ECM微环境
质谱法是研究蛋白质组学的主要方法。为进一步了解UCEM的蛋白质组学，本研究使用质谱法鉴定和分析了UCEM的蛋白质成分。在三个生物重复中，共鉴定出1368种蛋白质，超过了在Matrigel中发现的蛋白质数量（图3A）。此外，与Matrigel相比，UCEM表现出更高的人类宫颈组织特异性蛋白丰度。核心基质组分析显示，UCEM中存在各种人类ECM核心基质组和核心基质组相关蛋白，包括胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、ECM调节因子、ECM附属蛋白和分泌因子。这些蛋白质的功能分类基于COG/ KOG数据库，主要与蛋白质修饰、信号转导和囊泡运输有关。利用GO富集进行的进一步分析表明，UCEM中的蛋白质具有双重作用，既是ECM的结构支撑，又参与细胞内代谢和细胞与ECM的相互作用（图3E）。
图3 UCEM的质谱检测和生物信息学分析
4.用UCEM支持CSCC有机体的形成和生长
本研究共收集了52例CSCC，记录了患者的年龄、HPV感染类型、临床分期（FIGO2018）和肿瘤大小等信息。消化过滤后，将CSCC细胞包埋固化在Matrigel和UCEM中，然后加入CSCC器官组织培养基中。7至10天后，在UCEM和Matrigel中均可观察到CSCC器官组织。31名患者的肿瘤细胞在Matrigel中自我组织形成了CSCC器官组织（59.62%），34名患者的肿瘤细胞在UCEM中形成了器官组织（65.38%）。其中，4例仅在Matrigel中形成，7例仅在UCEM中出现，其余均在两种培养基中培养（图4A和B）。采用卡方检验分析了两组的类器官培养成功率，结果显示差异无统计学意义（χ2=0.369，P> 0.05）。这表明，在CSCC的类器官培养中，UCEM可达到与 Matrigel 相似的成功率。与Matrigel相比，本研究观察到UCEM的类器官形成效率较低（图 4C）。然后，比较分析了UCEM和Matrigel 蛋白成分和含量的差异。结果显示，UCEM 中的层粘连蛋白含量明显低于Matrigel。层粘连蛋白可能是影响类器官形成效率的关键因素。层粘连蛋白是基底膜的主要成分，由三条不同的链（α、β和γ）组成，为ECM提供了结构支架。α、β和γ链的不同组合形成了各种层粘连蛋白同工型。本研究进一步分析UCEM的蛋白质组学，以明确UCEM中可能存在的层粘连蛋白同工型。在 UCEM 中检测到的层粘连蛋白亚基包括 LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2 和 LAMC1。可能的层粘连蛋白同工型包括层粘连蛋白2/211、层粘连蛋白 4/221、层粘连蛋白6/311、层粘连蛋白7/321、层粘连蛋白8/411、层粘连蛋白9/421、层粘连蛋白10/511 和层粘连蛋白11/521。细胞-层粘连蛋白相互作用失调是许多癌症的主要特征。层粘连蛋白家族的某些成员，包括层粘连蛋白-521/332/111，在肿瘤存活、癌细胞迁移和肿瘤侵袭中发挥着更为复杂的作用。
图4 在UCEM和 Matrigel中培养的CSCC有机体及其比较
此外，本研究还对有机体在UCEM和Matrigel中的生长过程进行了动态观察和比较。结果表明，与Matrigel相似，在UCEM中培养的CSCC器官组织保持球形结构和光滑形态。此外，在整个生长过程中，在UCEM和Matrigel中培养的有机体大小相当，没有统计学意义上的显著差异（P>0.05）。通过后，在UCEM 和Matrigel中培养的器官组织表现出相似的特性。值得注意的是，在UCEM 中冷冻保存的CSCC有机体可以成功地复活、再生和扩增。这些复苏的有机体保持了规则的球形结构和稳定的形态，这对于长期有机体培养和建立CSCC生物库非常有利。为了研究在UCEM和Matrigel中培养的CSCC类器官是否保持了CSCC组织的结构和表型特征，进行了H&E染色和多种标记物的免疫组化染色（图5）。
图5 原生肿瘤组织和CSCC器官组织的结构和表型特征
5.UCEM中的CSCC有机体与原生组织的转录更为相似
为进一步研究在UCEM中培养的CSCC器官组织的转录组学特征，对来自三名患者的原生CSCC组织以及在Matrigel和UCEM中培养的CSCC器官组织进行了mRNA测序。在三个生物重复中，CSCC组织、Matrigel培养的有机体和UCEM中的mRNA共表达量每组均超过1×104（图6A）。这表明Matrigel和UCEM这两种类器官培养方法都能有效保留原生CSCC组织的转录组学特征。本研究通过GTEx数据库（GTEX-S32W-1526-SM-4AD6Z、GTEX-TSE9-2726-SM-4DXSQ、GTEX-S4UY-1426-SM-4AD6Y、GTEX-TSE9-2826-SM-4DXTF），并对正常宫颈鳞状上皮组织、CSCC组织以及Matrigel和UCEM中的器官组织进行了主成分分析。如图6B所示，CSCC组织和器官组织与正常宫颈鳞状上皮组织不同，表明宫颈癌组织与正常组织之间存在显著差异。在肿瘤组织中，在Matrigel中培养的CSCC器官组织与原生CSCC组织不同，而在UCEM中培养的CSCC器官组织与原生CSCC组织更相似，但也有一些重叠。差异表达基因的热图也显示了在Matrigel和UCEM中培养的CSCC器官组织之间的差异，表明UCEM在一定程度上影响了CSCC器官组织的生命活动。在此基础上，本研究进一步分析了在Matrigel和UCEM中培养的CSCC器官组织的差异表达基因（折叠变化>2）。与Matrigel相比，在UCEM中培养的CSCC器官组织中有229个基因被显著上调，70个基因被下调。对差异基因的GO富集分析（图6D）显示，与免疫反应、信号转导和细胞粘附有关的GOBP明显富集。GOCC明显集中在细胞外区域，这反映了肿瘤细胞对 ECM 的重塑，并解释了肿瘤进化如何为癌细胞参与改变的 ECM 重塑提供了独特的生态位。GOMF主要与趋化因子、细胞因子活性调节、受体和碳水化合物结合有关。促炎基因的转录表明体内肿瘤相关免疫细胞的招募。KEGG富集分析（图6E）显示，涉及病毒蛋白-细胞因子相互作用和趋化因子信号转导的信号通路显著富集。这有助于阐明HPV感染以及E6 和E7病毒相关蛋白在宫颈癌发病中的作用。
图6 在UCEM和Matrigel中培养的CSCC有机体的转录组分析
6.UCEM培养的CSCC有机体的耐药性
本研究进行了体外药物试验，以评估在UCEM和Matrigel中培养的CSCC器官组织对化疗药物的反应。紫杉醇和TC联合疗法是治疗CSCC的常用化疗方案。将体外药物敏感性测试结果与一位晚期CSCC（2018年FIGO，IIB期）患者的临床治疗反应进行了比较。使用从活检中获得的患者肿瘤组织培养了CSCC 有机体，并对其进行了体外药物敏感性测试。用1μM紫杉醇联合10μM卡铂治疗3天后，观察到CSCC有机体解离（图7B）。这一结果证明了TC化疗方案对该患者的有效性。此外，放射学检查显示，使用TC方案治疗后，肿瘤大小较治疗前明显缩小（图7C）。这些结果表明，在体外类器官模型中观察到的治疗效果与患者的临床反应是一致的，这可以指导化疗药物的筛选。此外，肿瘤细胞与周围组织特定微环境之间的相互作用对肿瘤进展和化疗药物反应有显著影响。利用UCEM培养CSCC器官组织可以建立宫颈组织特异性微环境与宫颈鳞癌细胞之间的联系。在此基础上，比较了在不同浓度的卡铂作用下，UCEM和Matrigel培养的CSCC器官组织对化疗药物的反应（图7A）。有机体的活/死染色显示了不同浓度卡铂的细胞毒性作用（图7E）。卡铂处理后，CSCC 器质性细胞的外层细胞首先死亡。当卡铂浓度达到100μM时，有机体的生长受到明显抑制，导致直径缩小。同样，在化疗药物的作用下，有机体的活力和增殖也出现了剂量和时间依赖性下降（图7D）。化疗药物暴露时间的延长以及浓度的增加导致UCEM培养的CSCC器官组织对卡铂逐渐产生耐药性，因此与Matrigel相比，卡铂的增殖活性更高。接下来，本研究对来自10名CSCC患者的肿瘤器官组织的体外药物反应与匹配患者的临床反应进行了比较分析。本研究采用RECIST标准（1.1版），通过评估化疗前后的影像学变化来评估患者的临床反应。为了测试药物反应，使用UCEM和Matrigel培养CSCC有机体，并在体外将其暴露于TC方案。然后绘制了药物反应曲线。总的来说，UCEM和Matrigel培养的CSCC有组织细胞对化疗药物的反应都有很强的预测能力（图7F）。值得注意的是，不良反应患者（患者 6、8和9）的IC50（中位抑制浓度）值明显高于良好反应患者（患者1、2和5）（图7G）。
图7 用UCEM和Matrigel培养的CSCC有机体的药物检测
7.在UCEM中通过异种器官移植保留CSCC组织特征
为了确定在UCEM中培养的CSCC器官组织能否在体内再生肿瘤组织，本研究将从同一患者身上获得的在UCEM和Matrigel中培养的CSCC器官组织植入裸鼠皮下。每组10只裸鼠。植入1.5个月后，将裸鼠安乐死并切除皮下肿瘤进行比较。图8A所示结果显示，UCEM组和Matrigel组分别有6只（60.00%）和 7只（70.00%）裸鼠形成皮下肿瘤。值得注意的是，两组小鼠肿瘤形成的成功率在统计学上没有显著差异。在这些小鼠中，Matrigel组有两只完全形成皮下肿瘤，UCEM 组有一只完全形成皮下肿瘤，两组中均有五只形成皮下肿瘤（图8B和C）。两组的皮下肿瘤组织周围都观察到了血管（图8D）。本研究比较了两组皮下肿瘤的共同发生率（图8F），并使用配对样本 t 检验进行了统计分析。UCEM 组的平均体积为（54.47±21.07）立方毫米，质量为（52.32±23.74）毫克，而Matrigel组的平均体积为（44.70±31.87）立方毫米，质量为（31.84±16.91）毫克。然而，两组间皮下肿瘤的体积和质量差异无统计学意义（P>0.05；图 8G和H）。H&E染色和免疫组化染色显示，两组组织细胞形成的皮下肿瘤组织与 CSCC 组织相似，细胞增殖标记物KI67和HPV病毒感染标记物P16INK4a的表达也表明了这一点（图8E）。
图8 检测CSCC器官组织在体内的致瘤能力
8.总结与展望
总之，本研究证明，采用脱细胞技术制备的 UCEM既保留了ECM的结构成分，也保留了参与细胞活动的蛋白质成分。因此，UCEM能有效维持人体宫颈组织中ECM的特定微环境。实验证实，UCEM能够支持CSCC有机体的形成和生长。对CSCC器官组织的形态、结构、生长过程和致瘤能力的分析表明，在UCEM中培养的CSCC器官组织在多个方面的表现与Matrigel相当。转录组测序显示，与Matrigel相比，UCEM培养的CSCC器官组织中宫颈癌癌基因的表达水平更高，更接近于CSCC原生组织。因此，本研究表明，UCEM可以通过保留更多的宫颈癌癌基因来增强CSCC器官组织的肿瘤异质性，从而形成与原生CSCC组织非常相似的模型。这为研究宫颈癌的发病机制和治疗提供了一个前景广阔的平台，也为类器官技术的改进提供了创新思路。
文章来源:
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adl3511
来源：EngineeringForLife,生物医药前沿