细胞通过机械转导的过程感知和响应细胞外机械环境，包括静态和动态。在这个过程中，来自静态细胞外机械环境（例如，基质刚度、形貌、微图案细胞大小提供的机械力条件等）和动态外部机械负荷线索（例如，机械拉伸、流体剪切、压缩等）的信号被转导到细胞以调节细胞内信号级联。这最终会导致转录、基因表达、蛋白质合成和下游分子信号的变化。
间充质干细胞（MSCs）是一种特殊的祖细胞群，可以分化成多种细胞类型，包括骨骼、软骨、肌肉和脂肪细胞以及其他细胞类型。特别是，骨髓环境中 MSC 成骨与成脂性能和分化的平衡对于健康的骨稳态至关重要。目前，已经研究了生化线索影响 MSC 谱系成骨或成脂 的能力。例如，暴露于不同类型的骨形态发生蛋白（BMPs）导致 MSC 成骨或脂肪生成。还已经确定，机械物理线索，如机械拉伸负荷，可以介导 MSC 成骨或脂肪生成。然而，对于生化和机械物理线索，MSC 命运决定成骨细胞或脂肪细胞的潜在分子机制尚未完全揭示。
最近，专注于 MSC 成骨的研究表明，YES相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）在 MSCs 的成骨转录启动中起着核心作用。值得注意的是，绝大多数关于 YAP 对 MSC 成骨的机械物理控制的研究都涉及静态的细胞外机械物理线索—如上所述的基质刚度和细胞微图案大小。相比之下，关于 YAP 机械转导对 MSC 成骨转录的动态机械负荷控制知之甚少。
鉴于此，美国内布拉斯加大学林肯分校机械与材料工程系及弗吉尼亚联邦大学生物医学工程系的研究团队曾报告了 MSC 在 YAP 激活和由此产生的成骨转录和终末分化中对循环机械拉伸负荷的响应。这是第一项报告 MSCs 中 Hippo 和 YAP 机械信号的机械拉伸负荷控制以及 ROCK 和 F-肌动蛋白在通过 YAP 介导 MSC 成骨过程中的调节作用的研究。研究成果发表在 Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 期刊题为“YAP mechanotransduction under cyclic mechanical stretch loading for mesenchymal stem cell osteogenesis is regulated by ROCK”。
首先，在循环机械拉伸下测试 MSCs 中 YAP 机械转导之前，研究人员确认了拉伸诱导的 MSC 成骨分化。然后研究了拉伸诱导的 YAP 核转运。虽然在未拉伸的 MSCs 中整个细胞质和细胞核中都可以看到 YAP 的亚细胞定位，但循环拉伸触发了 YAP 向细胞核的易位（图1 A）。通过免疫细胞化学和 NIH ImageJ 量化 YAP 核定位阳性细胞的百分比（图1 B），观察到在 10% 应变和 1 Hz 频率下，MSCs中的 YAP 核定位在 1 h 循环拉伸时最多，因此在随后的测试中使用了这套方案。进一步评估拉伸后的 YAP 核转运（图1 C、D），发现循环拉伸显著增加细胞核内的 YAP 蛋白水平，同时降低细胞质 YAP 表达。这意味着 MSCs 中 YAP 动态机械传感响应外部机械拉伸负荷的潜在趋势。
Hippo 信号是 YAP 的潜在上游通路。如果 Hippo 信号通过大肿瘤抑制激酶（LATS）的磷酸化上调，那 YAP 也可能被磷酸化，从而导致 YAP 细胞质滞留和降解。相反，去磷酸化的 YAP 能够转移到细胞核进行激活。为了测试机械拉伸对这些机制的影响，接下来，研究人员对 MSCs 进行拉伸并评估YAP的磷酸化。当循环拉伸时，MSCs 在 S127 和 S397 位点的内源性 YAP 磷酸化显著降低。此外，LATS1（p-LATS1）的磷酸化被 30 min 的循环拉伸显著抑制，从而暗示 LATS 等 Hippo 通路可能参与 YAP 的拉伸调控。这些结果表明，循环拉伸负荷通过下调 YAP 磷酸化及其细胞质滞留来促进 MSCs 中的 YAP 核转运，并且抗-YAP Hippo 通路—p-LATS 的拉伸调控可能发挥相关作用。
基于上述发现，实验又通过用 YAP siRNA 转染 MSCs 来检测 YAP 在拉伸诱导的 MSC 成骨中的作用。据观察，在YAP siRNA 存在下，循环拉伸对关键成骨转录因子 RUNX2 蛋白表达的刺激作用被消除（图2 A、B）。通过 qRT-PCR 评估，沉默YAP 消除了拉伸诱导的成骨转录因子和基因标记物 RUNX2、ALP、COL-I 和 OPN 的增加（图2 C）。与这些数据一致，拉伸后 MSCs 显示出增强的骨样矿化，而这种效应被 YAP siRNA 破坏（图2 D、E）。这些结果表明，敲低 YAP 抑制循环拉伸诱导的 MSC 成骨，循环拉伸对 MSC 成骨转录和分化的促进依赖于 YAP 的功能作用。
研究表明，YAP 活性与 F-actin 的形成呈正相关。此外，机械拉伸负荷可以促进肌动蛋白细胞骨架重塑以组装 F-actin。考虑到 Rho / ROCK 是 F-actin 形成的上游信号调节因子，因此，实验测试了 Rho / ROCK 是否参与调节机械拉伸下 MSCs 中的 YAP 核转运。当 MSCs 在 Y27632（一种ROCK抑制剂）存在下暴露于循环拉伸时，拉伸诱导的 YAP 核转运被显著抑制（图3 A、B）。与此一致，Y27632 显著降低了循环拉伸引起的细胞核 YAP 滞留的增加（图3 C、D）。
最后，研究人员验证了 ROCK 在拉伸下对 F-actin 的控制。肌动蛋白应力纤维的形成在暴露于循环拉伸的 MSCs 中明显增强，而这种增强受到 Y27632 的破坏。这些结果表明，循环拉伸负荷通过 ROCK 诱导 F-actin 的形成，这有助于 YAP 在拉伸负荷下的核转运。
基于以上表明 ROCK 是 MSCs 中拉伸诱导的 YAP 核转运所必需的，因此实验还研究了抑制 ROCK 对拉伸下 MSC 成骨的影响。结果表明，当在 Y27632 下施加循环拉伸时，拉伸诱导的 MSC 成骨转录因子和基因表达以及矿化的增加显著降低。这表明，ROCK 抑制剂 Y27632 抑制循环拉伸诱导的 MSC 成骨。
综上所述，该研究考察了循环机械拉伸负荷下 MSCs 中的 YAP 机械传感及其对 MSC 成骨转录和分化的影响。实验发现，在 10% 应变和 1 Hz 频率下的循环拉伸触发了 MSCs 中的 YAP 核转运。这种拉伸诱导的 YAP 核转运是通过降低 S127 和 S397 位点的 YAP 磷酸化来实现的。此外，抗-YAP-调控的 Hippo 通路，LATS1磷酸化，被循环拉伸抑制。由于 YAP siRNA 损害了拉伸诱导的 MSC 成骨特性，因此循环拉伸诱导的 MSC 成骨转录和分化是由 YAP 核转运介导的。实验还表明，响应循环拉伸的 YAP 核转运被 ROCK 抑制剂消除，这表明 ROCK 和相关的下游级联反应（如 F-肌动蛋白）参与了 YAP 的动态机械负荷激活。因此，通过抑制 ROCK 可抑制拉伸诱导的 MSC 成骨。该实验数据可能为利用间充质干细胞的骨组织工程和骨骼再生医学提供启示。具体而言，间充质干细胞中 YAP 介导的成骨转录的动态机械负荷控制可能为潜在的机械转导机制和所需的机械负荷工具提供见解。
参考文献：Kim E, Riehl BD, Bouzid T, Yang R, Duan B, Donahue HJ, Lim JY. YAP mechanotransduction under cyclic mechanical stretch loading for mesenchymal stem cell osteogenesis is regulated by ROCK. Front Bioeng Biotechnol. 2024 Jan 11;11:1306002. doi: 10.3389/fbioe.2023.1306002. PMID: 38274006; PMCID: PMC10809151.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38274006/
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