背景：摩罗丹（MLD）是一种治疗慢性萎缩性胃炎（CAG）的中成药。然而，MLD 治疗 CAG 的作用机制 (MoA) 仍不清楚。目的：基于网络药理学阐明MLD治疗CAG的作用机制。研究设计：基于网络药理学整合计算预测和实验验证。
方法：通过LC-MS/MS对MLD化合物进行计算扫描，并基于网络目标预测方法识别化合物的目标谱。通过目标谱的层次聚类，将 MLD 中的化合物与用于治疗胃炎的西药进行比较。分析了MLD的关键生物功能模块，构建了草药-生物功能模块网络，以阐明MLD草药用于CAG的组合规则。实验上，在1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）诱导的GES-1细胞中，从表型水平和分子水平验证了MLD对不同生物功能模块的影响。
结果：计算结果表明MLD中化合物的目标谱可以覆盖文献报道的大部分生物分子。MLD的MoA可以涵盖大多数CAG西药的MoA类型。MLD治疗CAG涉及多种生物功能模块的调节，例如炎症/免疫、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、消化和代谢。实验结果表明，MLD能够抑制MNNG诱导的GES-1细胞增殖，促进细胞凋亡和分化，降低炎症水平，促进脂滴积累。
结论：结合计算预测和实验验证的网络药理学框架为探索MLD的MoA提供了新的途径。
介绍
慢性萎缩性胃炎（CAG）是最常见的消化系统疾病之一，以粘膜萎缩、血管裸露和粘膜结节为特征。CAG与肠上皮化生和不典型增生一起，也是从炎症到肠型胃癌（GC）发病机制中的主要癌前病变之一。诊断患有 CAG 的患者通常会出现上腹疼痛、消化不良、腹胀、恶心、呕吐、嗳气、食欲不振和体重减轻。最重要的是，患有 CAG 的患者患 GC 的风险增加，估计每年 GC 的风险为 0.1%/年。尽管如此，一些病理学家声称 CAG 是一个可逆过程，并且在根除幽门螺杆菌 (HP) 后可能会出现改善。
摩罗丹 (MLD) 已在临床上用于治疗 CAG 数十年。MLD含有18种草药，即白芍、白术、百合、川芎、当归、地榆、茯苓、鸡内金、九节菖蒲、麦冬、蒲黄、三七、石斛、乌药、玄参、延胡索、茵陈、泽泻。临床研究表明，MLD 可以改善 CAG 的组织学、内镜检查结果和症状。研究表明MLD联合雷贝拉唑三联疗法治疗HP相关慢性胃炎效果更佳，可显着改善临床症状。杜等人。（2015）研究表明，与叶酸联合维生素E相比，MLD能有效改善胃粘膜萎缩和肠化生，特别是逆转低度上皮内瘤变。实验研究表明MLD在治疗CAG方面具有多种药理作用，包括抑制炎症、平衡免疫、调节胃肠动力、调节胃液分泌并改善胃癌前病变。然而，MLD治疗CAG的机制仍不清楚。
网络药理学是理解多组分药物的一种有前途的方法提出了一个新概念“网络靶点”，它将单个分子上的药物靶点概念扩展到其对生物网络的系统作用，以解决草药配方等多种化合物系统的问题。“网络靶标”作为中药网络药理学的核心概念，为分析中药复方的生物学基础、指导中药有效成分的发现提供了潜在的研究策略。中医网络药理学的理论和方法已成功应用于分析中药配方，如葛根芩连汤、六味地黄丸、清络饮、血必净和柴胡疏肝散。中医网络药理学理论一直在不断发展，在中医方剂智能推荐、胃癌极早期细胞的发现等诸多领域取得了巨大成就。
为了解决 CAG 治疗中 MLD 的系统性MoA，我们通过整合网络药理学评估和实验验证来实施系统策略。对MLD中化合物的靶点进行了预测，预测结果的准确性非常高。将MLD的化合物与用于治疗胃炎的西药进行比较，结果表明MLD可能具有与西药相似的效果。构建MLD的草药-生物学功能网络来解释MLD治疗CAG的调节作用。实验验证表明，MLD能够抑制1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）诱导的GES-1细胞增殖，促进细胞凋亡和分化，降低炎症水平，促进脂滴积累。这项研究提供了一种有前途的方法来解释 MLD 等草药配方发挥治疗作用的 MoA，并提供了一个连接计算预测和实验验证的系统框架。本研究的流程如图1所示。
材料和方法
MLD化合物的鉴定及治疗胃炎西药的收集
采用LC-MS/MS对样品MLD的化学成分进行定量，结果见表1（文末）。首先，仔细称取98个标准品，用甲醇将每个标准品的一级标准储备液配制成10 mg/ml。然后，仔细配制98个标准品的储备液，然后用20%甲醇稀释成系列最终混合标准工作液：1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2和0.1纳克/毫升。将MLD研磨，准确称取MLD样品3份，每份50mg，进行检测。将研磨好的样品转移至2ml离心管中，加入1ml 80%甲醇，涡旋混合2分钟，超声处理20分钟，再次涡旋混合2分钟，最后在13,000rpm、4℃下离心10分钟。使用20%甲醇将上清液稀释10倍或100倍用于进一步LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS分析在清华大学医药技术中心AB SCIEX QTRAP 5500三重四极杆质谱仪上进行，具有正、负ESI电离模式和MRM扫描模式。LC 分离通过 XSelect HSS T3 分析柱（2.1 × 100 mm，2.5 μm，Waters）完成，Exion LC AD 系统（AB Sciex）配备二元梯度泵。分别使用乙腈和0.05%甲酸水溶液作为溶剂A和B，流速为0.2ml/min。梯度曲线从 0% 溶剂 A 开始，然后在 17 分钟内线性增加至 100% 溶剂 A 并保持 2 分钟，最后在 2 分钟内线性下降至 0% 溶剂 A。柱温设置为 35 ℃，样品室温度设定为10℃，进样量为5μl。MS参数设置如下：ESI离子源温度设置为500℃；气帘气体设定为 30 psi；碰撞激活解离 (CAD) 气体设置：中，对于正电离模式和负电离模式，离子喷雾电压分别设置为5500V和4500V。离子气体 1 和 2 的参数设置为 50 psi。数据采集是通过AB SCIEX Analyst 1.7.1软件进行的，而数据分析是通过SCIEX OS-MQ 1.6.1软件进行的。
使用我们自己建立的数据库 HerbBioMap (Zhou et al., 2003) 将 MLD 的化合物映射到每种草药 (表 S1)。适用于胃炎的西药均来自 DrugBank (Wishart et al., 2017) 数据库。所选西药涵盖治疗胃炎的常用西药种类，包括H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、胃泌素抑制剂、胃动力药物、抗胆碱能药物、胃粘膜保护剂和根除HP的抗生素。西药详细信息见表S2。
蛋白质-蛋白质相互作用数据
在这项工作中，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据被用来构建分子网络。PPI 数据来自多个公共 PPI 数据库 HPRD（第 9 版）（Keshava Prasad 等人，2009）、BioGRID（2019 更新）（Rose等人，2018）、IntAct（Samuel 等人，2011）、MINT（ 2012 年更新 Homo sapiens) (Luana et al., 2012)和 STRING (V10.5) (Damian et al., 2016)。去除重复的基因后，最终关注了18,127个基因和523,380个相互作用。
MLD 中化合物的目标预测
MLD 中每种化合物的靶标分布均由我们之前建立的高性能 DrugCIPHER-CS 预测（Zhao 和 Li，2010）。DrugCIPHER-CS是一种全基因组药物靶点预测方法，它使用回归模型建立MLD中的化合物与蛋白质之间的关系。具体来说，DrugCIPHER-CS计算MLD的化合物-种子药物的化学相似性向量和药物-蛋白质的接近向量之间的相关性得分，并估计化合物-蛋白质相互作用的可能性作为最终的计算结果。药物 d 和蛋白质 p 之间的紧密度可以公式化如下：
药物 d 和蛋白质p 之间的可能性定义为一致性分数：
预测目标的文献挖掘验证
由于这里对各化合物的靶点进行了计算预测，因此需要验证预测结果的可靠性。我们通过文献挖掘验证了预测目标。对于MLD中的每个化合物，我们首先从国际公共数据库PubMed和中国数据库CNKI中按摘要名称检索已报道的生物实体，例如基因、RNA或蛋白质，并统计检索到的论文总数。其次，下载所有检索到的摘要，并对摘要中提到的生物实体进行扫描和提取。为了得到统一的结果，根据生物实体的名称将英文挖掘结果（PubMed）和中文挖掘结果（CNKI）进行合并。最后，每种化合物的预测目标可以直接或间接连接到挖掘的生物实体（PPI或信号通路），因此可以通过以下方式计算精度：
化合物的层次聚类
我们通过层次聚类将MLD 中的化合物与用于治疗胃炎的西药进行比较。对于每种化合物，所有 1950 个可药物靶标的分数均从 DrugCIPHER-CS 获得并用于聚类。西药的成药靶点也按同样的方法计算。K 均值聚类用于通过平方和 (WSS) 内的总数来评估聚类数量。当簇数设置为6时，WSS大幅下降，且变化相对平稳。因此，根据评价结果最终确定了6个簇。然后使用欧氏距离进行无监督层次聚类。
生物功能模块网络的建立
为了研究MLD中草药的生物学功能，我们首先建立了生物学功能模块网络。根据关键词映射和语义描述，对所有KEGG信号通路/GO生物过程进行分类。在语义描述上，对每个KEGG信号通路/GO生物过程术语进行人工阅读和理解，然后将其分类为不同的生物功能模块，例如炎症/免疫、细胞增殖、细胞凋亡等。在关键词映射方面，我们从国际公共数据库中收集了胃炎到GC的临床数据，得到了细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等从炎症到癌症发病的关键生物学过程组成的功能网络（郭等人，2017b)。
MLD靶点计算及MLD中药材功能富集分析
并获得 MLD 的目标。为了深入了解每种草药的详细功能，我们首先以与MLD相同的方式获得每种草药的目标（Liang et al., 2014）。然后，我们使用注释、可视化和综合发现数据库 (DAVID) 检查了每种草药靶标显着丰富的生物过程（Dennis 等，2003）。主要检查各药材的靶点富集KEGG信号通路/GO生物过程。在这里，我们保留了所有富集的 KEGG 信号通路/GO 生物过程（p值 < 0.001）。每种草药富集的KEGG信号通路/GO生物学过程列于表S3中。
草药-生物功能模块网络的构建
还对MLD靶点进行了富集的KEGG信号通路/GO生物学过程，MLD靶点主要分布在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、免疫/炎症、代谢和消化生物功能模块（表2见文末）。草药-生物功能模块网络给出了MLD中草药与6个关键生物功能之间的关系模块。该网络还包括基因（表 S4）。基因的选择规则是：（1）基因的表达能够表征生物功能模块的变化。 (2)与CAG或MLD发病机制相关的基因的作用。如果该模块的 KEGG 信号通路/GO 生物过程显着富集（p 值 < 0.001）计数在所有模块中排名前 3 或 KEGG 信号通路/GO 显着富集计数，则一组草药组连接到一个生物功能模块该模块的生物过程不少于5个。一个生物功能模块与其他生物功能模块相连，如果它们相关的KEGG信号通路/GO生物过程中具有相同的基因。如果一个基因在 PPI 网络中连接，则它们与其他基因相连。
试剂和细胞培养
塞来昔布（纯度：99.3%）购自solarbio（中国北京）。加入 10 ml 的 MLD，配制 0.25 g MLD/ml 溶液。dd H2O 加入 2.5 g MLD（中国河北邯郸制药有限公司）粉末，37℃水浴 30 min，超声处理 1 h，7000 g 离心 2 min，上清液滤过0.22 μM 过滤器。
将细胞在塑料瓶或多孔板中于 37°C、5% CO2 的湿润气氛中培养，使用含有 10% 胎牛血清、50 U/ml 青霉素和 50 mg/ml 链霉素的 RPMI-1640 培养基。指数生长的细胞用于实验。对于定量增殖测定，将 6 × 10[3] 个细胞接种到含有常规生长培养基的96 孔板中。孵育24小时后，将细胞在含有溶解在dd H2O中的2500μg/ml MLD或溶解在二甲基亚砜（DMSO）中的100μM塞来昔布的培养基中孵育。在含有0.1％DMSO的培养基中培养的对照细胞，证实对细胞生长没有影响。
细胞增殖测定
将细胞接种于96孔微孔板（6000个细胞/孔，100μl）中，并在加湿培养箱中常规培养24小时。预培养 24 小时后吸出培养基，更换为含有塞来考昔 (100 μM) 和/或 MLD (2500 μg/ml) 的培养基。孵育 48 小时后，通过Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 测量细胞活力（日本九州同仁岛）根据制造商的说明。ELISA：测定细胞上清液中的TNF-α和IL-6活性12孔细胞用20 μM MNNG刺激8 h建立炎症模型(Tong et al., 2021)，加药24 h收集上清液。使用KeyGen BioTECH（中国江苏）的ELISA试剂盒根据制造商的说明测定细胞上清液中TNF-α和IL-6的活性。
TdT 介导的 dUTP 末端标记 (TUNEL) 染色
将细胞置于玻璃盖玻片上，固定在 4% 多聚甲醛中（室温 20 分钟），然后用 0.1% Triton X-100 透化（室温 30 分钟）。然后，使用一步TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（KeyGen BioTECH，江苏，中国）根据制造商的说明评估细胞凋亡率。使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。
碱性磷酸酶 (ALP) 活性的测量
将细胞以 1 × 10[5] 个细胞/ml 的密度接种在 12 孔微孔板中，并用塞来昔布 (100 μM) 和/或 MLD (2500 μg/ml) 处理 48 小时，然后进行 ALP 活性测定。然后用非变性组织/细胞裂解液（Solarbio，北京，中国）溶解细胞。最后，使用 QuantiFluoTM 碱性磷酸酶测定试剂盒（BioAssay Systems，加利福尼亚州，美国）在 360/450 nm 处通过荧光测定 ALP 活性来测量 ALP 活性。在此分析中进行了两个独立的实验。
BODIPY 493/503 染色
每组细胞（4.8 × 10[4] 细胞/孔，1 ml）接种于含 RPMI 1640 加 10% FBS 的 12 孔板中。接种后 124 小时的细胞血清饥饿 1 小时，用 BODIPY® 493/ 503（Invitrogen，加利福尼亚州，美国）和 DAPI（KeyGen BioTECH，江苏，中国）染色 25 分钟，并使用荧光显微镜成像。
蛋白质印迹法
使用RIPA缓冲液（Solarbio，北京，中国）提取细胞中的总蛋白，并使用BCA蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国）检测浓度。简而言之，将上清液(40 μl) 与 5 × SDS-PAGE 上样缓冲液(10 μl) 混合，并在 98 °C 下变性 5 分钟。用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离不同样品中的蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯微孔膜上。跨膜后，用溶解在TBST中的5%脱脂牛奶封闭膜2小时，然后与一抗在4℃下孵育12小时。用TBST洗涤后，将膜与二抗在室温下孵育2小时，并通过奥德赛红外成像系统（Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE，USA）进行测定。
统计分析
所有单因素方差分析（ANOVA）的实验统计计算均使用GraphPad Prism 8.0软件进行。实验结果以平均值±标准差表示，p值<0.05表示显着。
结果
MLD 中的化合物鉴定和目标预测
使用 LC-MS/MS 扫描了 98 种 MLD 化合物（表 1 和图 2）。同时，从我们自己建立的数据库HerbBioMap中获得了每种化合物相应的草药（Hu，2006；Zhao等，2013；Zhong等，1996；Zhou等，2003）。每种草药的化合物计数和每两种草药的重叠大小如图 3A 所示。由于MLD成分复杂且缺乏相应的靶标记录，我们构建了系统策略来预测和验证MLD中化合物的潜在网络靶标。在这里，每个化合物的网络目标是通过我们基于网络的计算预测方法 DrugCIPHER-CS (Zhao and Li, 2010) 获得的。我们选择前 100 个预测目标作为每个化合物的网络目标。为了获得每种草药的靶点，我们以与我们之前的工作相同的方式（Liang et al., 2014）评估靶蛋白与单味药理作用相关的概率，并得到每种草药的靶点。每种草药的目标计数和每两种草药的目标重叠大小如图 3B 所示。
在 18 种 MLD 草药 Lilium lancifolium Thunb (LLT), Smilax glabra Roxb. (SGR), Scrophularia ningpoensis Hemsl. (SNH), Alisma plantago-aquatica L. (APA), Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker Gawl. (OJKG), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (ASD), Atractylodes lancea (Thunb.) DC. (ALD), Artemisia capillaris Thunb. (ACT), Paeonia lactiflora Pall. (PLP), Ligusticum chuanxiong Hort. (LCH), Panax notoginseng (Burkill) F.H. Chen (PNF), Corydalis yanhusuo (Y.H.Chou & Chun C.Hsu) W.T.Wang ex Z.Y.Su & C.Y.Wu (CYWZC), Typha angustifolia L. (TAL), Galli gigerii endothelium corneum (GGEC), Sanguisorba officinalis L. (SOL), Acorus gramineus Aiton (AGA), Lindera aggregata (Sims) Kosterm (LAK),分别发现了2、2、6、10、5、15、2、6、11、11、2、7、7、1、3、1和1个化合物，其对应于100、100、320、116、207、182、100、204、200、183、100、233、302、0、192、0和0目标值（表S1）。统计结果显示，不同药材中化合物的重叠度很低，除LCH和ASD外，不超过7个化合物（图3A）。然而，草药目标的重叠度相对较高（图3B）。这一结果表明，虽然中草药的成分不同，但中草药干预的靶点和生物学功能可能仍然相似。这也印证了本草多成分、多靶点的特性。
MLD 中化合物的目标预测和验证
我们通过文献挖掘验证了每种化合物预测网络目标的可靠性。出现在一篇或多篇摘要中的每种化合物和生物实体的共现用于定义它们之间的关联。统计结果表明，每个化合物的预测靶点可以覆盖80-95%的已报道的分子机制（图4A），这意味着每个化合物的预测靶点可以很大程度上与文献报道的分子机制相关，并且可以用于每种化合物的综合功能表征。各预测目标化合物可以直接或间接（PPI 或信号通路）连接到开采的生物实体。在图4A中，我们发现87%的芍药苷（一种来自芍药的化合物）与报道的生物实体有关。而其他 13% DrugCIPHER-CS 目标位于与挖掘的生物实体相关的信号通路上游，如图 4B 所示。
MLD与治疗胃炎的西药药理作用相似
为了描述 MLD 治疗 CAG 的作用机制，通过对 1950 年可药物靶标概况进行分层聚类，将 MLD 化合物与用于治疗胃炎的西药进行比较。层次聚类在许多生物研究领域表现出了高性能，例如单细胞（Wang et al., 2021）等。我们从 DrugBank (Wishart et al., 2017) 数据库中收集了用于治疗胃炎的西药。入选的西药涵盖了治疗胃炎的常用西药类型，包括H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、胃泌素抑制剂、胃动力药、抗胆碱药、胃粘膜保护剂和HP抗生素等。这仍然是26种治疗胃炎的西药（表S2）。我们筛选了98个MLD化合物和26个治疗胃炎的西药，建立了化合物库作为金标准参考。根据 DrugCIPHER 评分将 MLD 化合物与金标准进行比较。对所有化合物进行层次聚类，展示库中124个化合物的距离和分组情况，其中包括精选的98个MLD化合物和26个西药。
6 个簇被确定为具有最佳总 WSS（图 5A），并且化合物的层次聚类显示 MLD 化合物具有相似的预测分数，大部分聚集在一起（图 5B）。22 个（22.45%）MLD 化合物与西药聚类。具体来说，13 种化合物与 H2 受体拮抗剂、胃动力药物、胃粘膜保护剂和HP抗生素。6 种化合物集中在胃动力药物、HP 抗生素、抗胆碱能药物和胃泌素抑制剂中。3个与胃粘膜保护层簇集。MLD 的 76 种化合物不与任何西药聚类。这一结果支持了我们的假设，即 MLD 化合物可能具有与西药相比，对胃炎的治疗效果更广泛。质子泵抑制剂奥美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑、埃索美拉唑和右兰索拉唑聚集成一个亚类。结果表明，无监督层次聚类能够反映化合物结构和MoA的相似性和差异性。
MLD调控CAG相关生物功能模块
为了揭示 MLD 对CAG 的综合影响，我们采用了统计策略来衡量 MLD 可能影响的目标。一些目标蛋白可能出现在许多化合物的目标谱中。我们推断，此类目标蛋白很可能是草药配方药理作用的关键参与者，并代表草药配方中多种化合物的综合作用。我们以与之前研究相同的方式计算 MLD 的目标（Liang et al., 2014）。
然后，我们按照之前研究的相同方式建立了CAG的生物功能模块网络（Guo et al., 2017b）。我们通过生物功能模块网络富集了MLD靶点，发现MLD显着富集的KEGG信号通路/GO生物学过程主要分布在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、炎症/免疫、代谢和消化等模块中。如表2所示。值得注意的是，MLD相关的一些生物学功能已被报道，例如MLD可以调节胃肠道运动(Jiang et al., 2017)、胃分泌(Jiang et al., 2017; Xie et al. ., 2016)、COX-2 (Zhao et al., 2016) 和 EGF (Li et al., 2013; Yan等人，2015）。我们收集了有关MLD化合物对胃细胞系生物功能模块的干扰的相关报道（表S5）。MLD 的多种成分可以抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节胃细胞系的消化。例如，白术内酯II可以抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡（Tian和Yu，2017），延胡索乙素显着抑制胃粘膜基础胃酸的形成以及组胺诱导的胃粘膜和壁细胞的胃酸分泌（Yu等，2017）。，1993）。这说明MLD确实具备了调控这些生物功能模块的物质基础。
我们以与MLD相同的方式推断各中药的靶标，并利用表2中的KEGG信号通路/GO生物过程对各中药的靶标进行富集分析过程。对于各中药，显着富集的KEGG信号通路/GO生物过程留下作为最终的KEGG信号通路/GO生物过程。为了了解MLD等多成分治疗系统如何发挥治疗作用，构建了关键的草药-KEGG信号通路/GO生物过程-分子网络，以揭示草药、生物功能和分子之间的关系（图6）。这些结果可以帮助我们从生物分子网络的角度更好地阐明MLD治疗CAG的组合规则。
如图6所示，君药具有滋阴清热的功效，可调节炎症/免疫、细胞增殖、细胞凋亡和细胞分化模块。陈氏药在MLD中以补脾胃、活血益气、消食为主，主要调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、炎症/免疫和代谢模块。左药以清热凉血为主，调节炎症/免疫、细胞增殖、细胞凋亡和细胞分化模块。石草药，行气血，调节消化和细胞增殖模块。各药材丰富的KEGG信号通路/GO生物学过程列于表S3，各药材的传统功能列于表S6。
君药材Lilium lancifolium Thunb，陈药材Atractylodes lancea (Thunb.) DC。和三七(Burkill) FH Chen，石芍药 Pall。全部显着（p 值 < 0.05）富集细胞群增殖，在表 2 列出的 KEGG 信号通路/GO 生物过程中排名前 1。具体来说，百合、苍术 (Thunb.) DC.、三七 (Burkill) F。
H. Chen 和芍药。富含细胞增殖，调整后的 p 值分别为 4.57E-08、1.10E-08、4.57E-08 和 7.70E-08。我们还注意到，它们都已被报道可以抑制胃细胞系的增殖（Guo et al., 2017a; Jia, 2015; Li et al., 2020; Shi et al., 2001）。Herb-KEGG信号通路/GO生物过程-分子网络有助于我们从生物分子网络角度更好地理解MLD在治疗CAG中的传统功能和现代MoA。
MLD抑制MNNG诱导的GES-1细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞分化、降低炎症水平并增加脂质积累
为了验证网络药理学分析预测的生物过程对 MLD 的影响，进行了一系列细胞生物功能测定。首先，使用 MNNG 诱导的 GES-1 细胞作为模型细胞系 (MNNG-GES-1) (Liu et al., 2013)。MNNG 是一种活性 N-亚硝基化合物，可模拟硝酸盐的不当摄入，从而导致 CAG 等癌前病变（Xu等，2018）。MNNG经常被用来建立CAG模型（Zhang等，2016；Zhu等，2013）。然后，我们在体外检测了MLD对MNNG-GES-1增殖的影响。如图S1和7A所示，我们观察到MLD抑制增殖，计算出的IC50值约为2500 μg/ml。接下来，在这项研究中，MNNG刺激GES-1细胞引起胃粘膜急性炎症模型。进行 ELISA 分析细胞上清液中的水平。MLD干预后，与模型组相比，TNF-α（图7B）和IL-6（图7C）的分泌减少。此外，为了确定MLD是否能够影响MNNG-GES-1细胞的细胞分化，检测了ALP活性。ALP 在正常胃细胞中呈阴性，在胃癌细胞中呈阳性（Miki 等，1976；Zhao 等，2005）。实验结果显示，MLD干预后，碱性磷酸酶活性显着降低，显着诱导胃癌细胞分化（图7D）。此外，我们通过 TUNEL 分析监测 MNNG-GES-1 细胞的细胞凋亡。暴露于2500μg/ml MLD后，细胞表现出明显的凋亡（图7E）。最后，我们使用 BODIPY 493/503 染色评估了脂质积累的变化，并表明 MLD 显着促进了 MNNG-GES-1 中脂滴的积累（图 7F）。
网络药理学预测表明，多个候选靶点与上述生物过程相关，我们检测了CDK4（细胞周期蛋白依赖性激酶4）的蛋白表达水平 (Sherr 等人，2016)、B 细胞淋巴瘤-2 (Bcl-2) (Siddiqui 等人，2015)、肉碱棕榈酰转移酶 1A (CPT1A) (Wang 等人，2020) 和 NF-κB1 (DiDonato 等人) al., 2012)，分别与细胞增殖、凋亡、脂肪酸代谢和炎症有关。模型组中CDK4（图7G）、Bcl-2（图7G）、CPT1A（图7H）和NFκB1（图7I）的表达水平高于GES-1组，而模型组的表达水平高于GES-1组。MLD组的表达与GES-1组的表达比模型组更相似。总之，MLD可以抑制MNNG诱导的细胞增殖、促进细胞凋亡、促进脂滴积累并降低炎症水平。
MLD可显着改善CAG的临床症状，尤其是重度不典型增生患者。MLD的相关研究主要集中于临床试验和实验研究。临床试验表明，MLD可显着改善胃黏膜不典型增生、红斑和胆汁反流，在改善上腹痛、嗳气、厌食等症状方面效果优于叶酸(Tang et al., 2016)。实验研究发现MLD可以通过减轻胃粘膜炎症、修复胃窦粘膜G、D细胞、控制和调节胃肠激素的分泌来治疗萎缩性胃炎(Xie et al., 2016)。由于MLD化合物的复杂性以及研究中药方剂MoA的有效理论和系统研究方法的限制，目前关于MLD治疗CAG的整体MoA的报道较少。
本研究通过测定MLD可能作用的靶点，获得MLD可能影响的生物功能模块，构建herb-KEGG信号通路/GO生物过程-分子网络，从而阐明MLD的网络调控机制在CAG的治疗中。计算结果表明MLD通过调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、炎症/免疫、代谢和消化等生物功能模块来治疗CAG。通过在MNNG诱导的GES-1细胞中的实验验证，我们证明MLD可以抑制细胞增殖，促进细胞分化和细胞凋亡，降低炎症水平并促进脂滴积累。结果表明，结合计算预测和实验验证可以有效地探索MLD的MoA。
CAG治疗可以提高疗效，改善患者的临床症状和内镜特征，可能是与炎症细胞因子 IL-6 和 TNF-α 的抑制有关（Machado 等，2003）。NF-κB信号通路也是CAG发病机制中的关键通路。NF-κB可以被多种信号通路激活，例如Toll样(Smith等，2003)和NOD1(Viala等，2004)。抑制NF-κB信号通路的激活可以抑制胃炎向胃癌的转化(Keates et al., 1997; Tomita et al., 2011)。CAG 可通过 P53/Bcl-2 信号通路进展为胃癌 (Liu et al., 2018)。一些中药，如参芪消痞颗粒，可以明显改善萎缩性胃炎大鼠的黏膜萎缩，其机制可能与下调Bcl-2等关键分子的表达有关(Zhao等，2016)。此外，CPT1A介导的脂肪酸氧化激活会增加 GC 细胞的增殖和迁移，而抑制CPT1A 诱导的脂肪酸氧化会抑制胃癌细胞的进展 (Wang et al., 2020)。这些报告与我们的实验结果一致（图7）。
这项研究存在一些局限性。首先，MLD 的一些化合物被忽略，这可能会在分析中产生偏差。幸运的是，我们的系统预测可以在一定程度上弥补这一损失。其次，在分子水平的验证实验中，仅选择能够表征相应生物功能模块变化的分子。未来我们将进行更多的实验，进一步验证各个生物功能模块。第三，MLD能够治疗CAG的基础是它含有大量的化合物。未来，我们将进行更多的实验来探索MLD中关键化合物的作用机制。
总之，本研究表明，结合中医网络药理学和几种不同的实验方法可以有效阐明MLD治疗CAG的潜在生物学分子机制。该研究也为破译中药方剂的药理机制提供了科学途径，进一步指导MLD的实验验证和临床应用。
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