许多微生物积累相容性溶质来抵消高渗透压、高温、干燥和冷冻等外部压力。在众多相容性溶质中，四氢嘧啶以其显著的功效脱颖而出，它能有效保护嗜盐细胞免受渗透压失衡，维持细胞内生物大分子的稳定性。
最近的研究表明，四氢嘧啶应用于人体皮肤时具有美白、保湿、抗氧化、抗衰老和防止紫外线辐射的潜力；四氢嘧啶还可用于治疗炎症性疾病，如过敏性鼻炎、鼻结膜炎、气管炎和肺部炎症。这些高价值应用使其目前售价约达到 1000 美元/公斤，也助推了生产方法的发展。
目前，通过微生物发酵生产四氢嘧啶已推进至大规模，并开发了多种发酵策略来提高产量、降低生产成本、简化生产工艺。
工业上，四氢嘧啶的生物合成途径已在伸长盐单胞菌（H. elongata）中得到了清晰的阐明。近几十年来，四氢嘧啶的低盐发酵在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母和巴氏芽孢杆菌中实现。此前研究中，基于工程化大肠杆菌可得到 25.1 g/L 四氢嘧啶，生产率为 0.84 g/L/h。
（来源：ACS Synth. Biol.）
近日，在ACS Synth. Biol.上发表了题为“Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for Highly Efficient Production of Ectoine”的研究通过异源表达来自伸长盐单胞菌的四氢嘧啶生物合成操纵子ectBAC基因，对谷氨酸棒杆菌进行改造以生产四氢嘧啶，通过遗传修饰，包括引入来自大肠杆菌 BL21（DE3）的de3 基因来表达 T7 启动子，消除赖氨酸转运蛋白 lysE 以限制赖氨酸的产生，并对天冬氨酸激酶进行靶向突变lysCS301Y以减轻赖氨酸的反馈抑制。得到工程菌株 Ect10 在优化的补料分批发酵中获得了四氢嘧啶滴度为 115.87 g/L，代表了谷氨酸棒杆菌中最高的四氢嘧啶生产水平，实现了低盐环境下四氢嘧啶的高效生产。
谷氨酸棒杆菌是一类高 CG 含量的革兰氏阳性菌，是全球氨基酸发酵行业的主要生产者。由于 L-赖氨酸和四氢嘧啶具有共同的前体L-天冬氨酸半醛，谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌株被认为是四氢嘧啶生产的最佳宿主。近期研究中，基于工程菌株C. glutamicum ectABCopt，补料发酵时四氢嘧啶产量为 65 g/L，产率为 1.16 g/L/h。
由于谷氨酸棒杆菌的工业重要性，迫切需要高效稳定的基因组编辑系统。CRISPR-Cpf1 系统在谷氨酸棒杆菌基因编辑方面具有明显的优势该系统由FnCpfl、CRISPR RNA 和同源臂组成，只需一轮同源重组即可实现基因编辑，大大减少了时间和工作量。
该过程还涉及FnCpf1 在特定序列处切割靶 DNA，产生粘性末端，从而通过同源重组促进基因删除和插入。随后，利用质粒的温度敏感性来消除自身，从而产生转基因菌株。
对于ectBAC表达系统的设计。这项研究选择了来自原始四氢嘧啶生产菌株H. elongata的ectBAC基因簇。T7 启动子的调节有效地将ectBAC操纵子的表达与高渗透压信号解耦。将 T7-ectBAC簇插入质粒 pDXW-10中，构建用于在谷氨酸棒杆菌中合成四氢嘧啶的质粒 pDXW-T7-ectBAC。
为了实现ectBAC基因簇的有效表达，使用质粒 pJYS3-de3 将来自大肠杆菌 BL21 (DE3) 的de3 基因插入谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 的基因组中，成功实现了谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶。
接下来是进行底盘设计来进一步提高四氢嘧啶产量。为了增加四氢嘧啶合成通量并提高前体和氧化还原辅因子的可用性，可以通过敲低、减弱或解除反馈抑制来调节天冬氨酸家族合成途径。
应用于高 L-赖氨酸生产菌株的构建策略可以适用于四氢嘧啶生产的谷氨酸棒杆菌菌株，从而有可能释放更高的四氢嘧啶滴度。根据前期研究，通过删除赖氨酸转运蛋白（LysE）来减弱赖氨酸的细胞外转运，可以有效减少发酵液中赖氨酸的积累。
细胞内高浓度的赖氨酸可以抑制天冬氨酸激酶的活性，天冬氨酸激酶是氨基酸天冬氨酸家族的限速酶。为了消除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制，研究人员根据文献报道，将天冬氨酸激酶 301 位点的丝氨酸突变为酪氨酸。
▲图丨四氢嘧啶生物合成途径（来源：ACS Synth. Biol.）
据报道，删除编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因以及用 sod 启动子替换tkt操纵子的天然启动子可以提高 L-赖氨酸的产量，因为流向草酰乙酸的碳流增加。这种方法可能为四氢嘧啶的合成提供更多的前体；此外，响应启动子替换，通过增加磷酸戊糖途径基因的表达进一步增加 NADPH 的供应。
本研究将H. elongata的ectBAC基因簇克隆到载体 pDXW 中，分别转化得到菌株 Ect01、Ect02、Ect03、Ect04 和 Ect05。在含有 100 g/L 葡萄糖的发酵培养基中，使用 Ect05 观察到最高四氢嘧啶滴度为 4.84 ±0.18 g/L。对比发现，NADPH 供应的增强对四氢嘧啶合成具有积极影响。
此外，天冬氨酸激酶的过度表达有效增加了四氢嘧啶的产量。四氢嘧啶的生物合成依赖于大量的 ASA。
将载体 pDXW-T7-ectBAC-lysCS301Y电转化至C. glutamicum(DE3)-ΔlysE-lysCS301Y中，产生菌株 Ect10。正如预期的那样，具有 pck 缺失和 tkt 启动子替换的四氢嘧啶生产者获得了更高的滴度。
Ect10 产生的四氢嘧啶的滴度升高至 4.94 ± 0.26 g/L，高于 Ect05，表明与仅表达ectBAC的菌株相比，天冬氨酸激酶的过表达促进了 L-天冬氨酸向四氢嘧啶的转化。
此外，研究人员评估了菌株 Ect10 生产四氢嘧啶的最佳培养温度为 30 °C 。在摇瓶发酵实验中，设置发酵培养基中的葡萄糖浓度为 10 g/L 、50 g/L 、100 g/L 、150 g/L 和 200 g/L 等五个不同的浓度梯度，同时所有其他相关条件保持恒定。结果显示，与其他组相比，在 100 g/L 浓度下获得了最高的四氢嘧啶产量 (5.09±0.20 g/L)，可能是由于在此条件下细胞生长和四氢嘧啶合成处于平衡状态。
接下来，为了评估工业相关条件下的性能，使用补料分批发酵模式在搅拌罐生物反应器中培养谷氨酸棒状杆菌工程菌株 Ect10。经过 78 h 的发酵，最终四氢嘧啶滴度达到 115.87 g/L，总体积生产率为 1.49 g/(L·h)，产量为 0.19 g/g。
综上所述，本研究中开发的谷氨酸棒状杆菌菌株已表现出迄今为止已知的最高四氢嘧啶生产滴度。这种创新方法未来在其他基于谷氨酸棒杆菌的菌株中具有巨大的潜在应用前景。
素材来源官方媒体/网络新闻
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