5′-磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5′-phosphate，PLP）是大约 160种细胞反应的必需酶辅因子，在代谢过程中发挥着重要作用。缺乏 PLP 会导致严重的影响，包括脂溢性皮炎、抽搐、小血球性贫血、周围神经病变、癫痫和抑郁等。
而且人和动物无法合成 PLP，如果缺失则需要通过外源补充。这使得 PLP 在制药、食品工业和牲畜饲料领域具有很高的应用价值。目前，PLP 的主要生产方式是化学合成，不过，这种方式存在产生副产物、温度高、氯化反应引发安全隐患等问题。
因此，领域内一直在探索高效生物合成 PLP 的策略。近日，来自江南大学的研究人员首次建立了利用伤寒沙门氏菌酸性磷酸酶（StAPase）和大肠杆菌吡哆醇氧化酶（EcPNPO）作为途径酶、以吡哆醇（PN）和焦磷酸盐（PPi）为底物合成 PLP 的补救合成途径。在双酶催化下，最优菌株生产 PLP 的产量最高达到了超 15 g/L，产率为 1.02 g/(L·h)。据悉，这是迄今为止报道过的最高生产率。
（来源：JournalofAgriculturalandFoodChemistry）
本文的通讯作者是江南大学生命科学与健康工程学院教授吴静，重点关注生物催化生产药物/中间体的应用基础研究。她在 C-C 和 C-N 裂合相关酶的挖掘、设计、改造和解析等方面有较好的研究基础，并基于这些人工蛋白元件设计了多种重要药物/中间体的人工生物合成路径。
在植物和微生物体内，PLP 主要有两种合成途径，分别是从头合成途径和补救合成途径。从头合成途径包括以植物等真核生物为代表的 1-脱氧-二羟糖-5-磷酸（DXP）非依赖性途径和以大肠杆菌等原核生物为代表的 DXP 依赖性途径。前者主要关注关键酶的酶学性质，后者通过代谢工程在 12 h 内合成 PLP 的滴度仅为 2.3 g/L。
相比之下，补救合成途径更为理想。这种途径以吡哆醇、吡哆胺或吡哆醛（PN、PM 和 PL）为底物，通过激酶催化发生磷酸化生成吡哆醇 5′-磷酸、吡哆胺 5′-磷酸或吡哆醛 5′-磷酸，最终通过氧化酶转化为 PLP。
不过，由于激酶需要昂贵的三磷酸腺苷（ATP）作为磷酸供体，一定程度上限制了其应用。而酸性磷酸酶（APase）只需廉价的磷酸盐供体包括焦磷酸盐（PPi）即可完成催化磷酸化工作，降低了生产成本，且对反应底物具有广谱性，因此在补救合成途径中显示出了取代激酶的潜力。
对于 APase 而言，需要不断提高其活性。其中来自伤寒沙门氏菌的酸性磷酸酶（StAPase）是一种非特异性的酸性磷酸酶，属于磷脂酸磷酸酶 2 型（PAP2）超家族成员。领域内对这种酶的研究起步较早，包括分析其基因序列、对 StAPase 重组蛋白进行晶体学分析、深入解析 StAPase 催化磷酸化化合物水解的机制。
基于此，在这项研究中，该团队首次构建了一种合成 PLP 的新型补救合成途径，以 StAPase 和 EcPNPO 为途径酶，以焦磷酸盐为磷酸供体，以吡哆醇为底物合成 PLP。并通过试验证明了 StAPase 和 EcPNPO 双酶途径可将吡哆醇转化为 PLP，这种方法是可行的。
然后，该团队鉴定出了 StAPase 催化吡哆醇磷酸化的效率较低是限速步骤。研究人员通过分子动力学模拟和量子力学计算解析了 StAPase的低活性的原因，发现这主要是由于其对吡哆醇的亲和力低以及发生水解副反应。
图| PN 合成 PLP 的途径设计与验证（来源：上述论文）
基于这些发现，研究人员提出了两种蛋白质修饰策略以提高 StAPase 的活性，改善吡哆醇与 StAPase 的结合，增强底物结合位点的疏水性以抑制水解副反应。通过蛋白质工程手段，该团队分离出了 StAPase 的最佳变体 M7，其表观二级速率常数 Kcat / Km 的比值比野生型提高了 4.9 倍，并进一步分析了其性能提高的机制。Kcat / Km 的比值大小可用于比较酶的催化效率。
最后，在 StAPase 最优突变体 M7 和 EcPNPO 的催化下，研究人员构建出了可高产 PLP 的菌株，经过 6 小时的反应，产量达到了 14.5±0.55 g/L，产率为 1.0±0.02 g/(L·h)，这为迄今为止报道的最高水平。
研究人员指出，这项研究有望为工业规模化生产 PLP 提供一种极具潜力的方法。
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