卤化化学在现代社会中具有不可替代的重要性。通过在化合物中引入关键的卤素原子，我们能够为化合物赋予特殊的功能，例如我们熟知的聚氯乙烯（PVC）、强效抗生素氯霉素以及阻燃剂溴化聚苯乙烯（BPS）等。这些卤代化合物已经在制药、农药和新型材料等领域得到了广泛的应用。
尽管卤代化合物的有机合成机制已得到深入研究并广泛应用，但高毒性、原子经济性不佳以及有限的立体/区域选择性等问题，使得在复杂分子中实现精准的卤化变得困难重重。同时，对最终产物中对映体纯度的严苛要求，常常导致这些化合物的分离和纯化过程变得极为复杂。
相较之下，生物合成途径为我们提供了一种绕过这些限制的可能。理论上，它能在接近环境条件的情况下，为卤化分子的生产提供一种有效且更环保的替代方案。通过结合新型合成工具和对微生物生物化学空间的深入探索，新的途径正在不断涌现，用以同化更多不常见的元素。这种范围的扩大正推动代谢工程从简单的 C-C、C-H、C-O、C-N 和 C-S 键向更具多样性的替代化学发展，从而极大地丰富了细胞化学的调色板。
近日，来自德克萨斯大学的研究团队利用卤素酶和下游途径，通过代谢工程和合成共培养物，以安全有效的方式生产出具有工业吸引力的卤化分子。他们建立了一个共培养系统，该系统使用混合和匹配技术来提供差异化的下游卤化类型和位置，从而实现了各种卤化分子的组合途径组装，并最终在葡萄糖中从头合成了26 种不同的卤化分子。
▲图 | 大肠杆菌中用于 L-色氨酸生产的代谢工程（来源：上述论文）
这项研究已经以”A modular and synthetic biosynthesis platform for de novo production of diverse halogenated tryptophan-derived molecules”为题发表在Nature Communications上。该论文的通讯作者是来自德克萨斯大学奥斯汀分校麦凯塔化学工程系的 Shruti Gadhiyar 和 Hal S. Alper，他们主要从事细胞与分子生物学领域的研究。
▲图 | （来源：nature communications）
在已有的研究中，尽管已经在谷氨酸棒状杆菌实现了 7-Br-色氨酸和 7-Cl-色氨酸从头生产卤代色氨酸，但没有研究报告表明可以在大肠杆菌中产生接近克级滴度的特定卤化产物。因此，研究团队首先评估了卤化酶和黄素还原酶辅因子再平衡对的合成表达，他们使用不同的表达方案对卤化酶 Th-Hal 和黄素还原酶 Th-Fre 和 EcFre 进行了评估，结果表明，原生黄素还原酶（EcFre）的表达水平不足以进行高水平的卤代色氨酸生产，而表达一个异源的、热稳定性更佳的黄素还原酶（ThFre）对于卤代色氨酸的产量提升显著。这一过程表明了优化卤化酶反应中的辅因子平衡的重要性。
随后，为提高卤化色氨酸产量的潜力，研究团队对卤化酶的卤化特性进行了比较。他们在不同温度下进行了色氨酸喂养实验，以测定这些卤化酶的稳健性以及它们对氯化和溴化的偏好。结果显示，卤化酶 XsHal 在多种温度下都表现出强大的体内生产能力，其催化效率在 5-氯-和 5-溴-色氨酸前体的生产上尤其显著；卤化酶 Thal 在 30 °C 下显示出对 6-氯-和 6-溴-色氨酸前体一致的生产能力；RebH 在 30 °C 下对色氨酸转化为 7-溴-和 7-氯-色氨酸前体的转化率一致。根据在 30 °C 下的优异转化能力，以及能够共同作用于色氨酸上的多个卤化位点（包括氯和溴）的特点，研究团队最终选择了XsHal、Thal和RebH三种卤化酶。
接着，研究团队采用了代谢工程方法来提高前体可用性，通过消除降解机制、消除反馈调节以及过表达生物合成途径中的酶，来改善前体的可用性，从而提高卤代色氨酸前体的产量。
他们首先删除了色氨酸酶和 TrpR 转录阻遏物基因，以减少色氨酸的降解并调节其生物合成和转运。同时，通过突变 TrpE、AroG 和 SerA 基因，使这些酶具有反馈抗性，并采用了合成代谢模块化方法（包括前体模块和色氨酸生物合成模块），来优化这些模块的表达强度和拷贝数。通过这些修饰，成功构建了一种能够高产色氨酸的大肠杆菌菌株（E. coli sKR-Trp4）。该菌株在含有低浓度葡萄糖的最小培养基中培养24 小时后，能够产生超过200 mg/L的色氨酸。最后，他们利用这种高产色氨酸的菌株，将之前表征的卤化酶纳入其中，从头生产卤代色氨酸前体。
通过转化不同的卤化酶，研究团队成功生成了三种能够产生不同卤化色氨酸的菌株。这些菌株在加入葡萄糖和相应卤化物盐的情况下，能够产生高滴度的卤化色氨酸，并且具有高选择性。
在此基础上，研究团队展开了通过互补混杂酶和喂养测定以实现初始卤素产品多样化的研究。研究的重点在于探索色氨酸这一化学结构复杂的氨基酸，通过酶催化反应在多个位置进行修饰，产生具有广泛应用的产品。研究中发现，五种酶（RgnTDC、iaaM、TnaA、KynA 和 McbB）能够转化所有加入的色氨酸，生成相应的理论产物；研究还涉及了酶对卤化色氨酸底物的不专一性（杂合性），即这些酶能够接受多种不同的卤化色氨酸作为底物，并将其转化为多样化的卤化下游产品。通过共培养方法，即让一个菌株主要负责生产卤化色氨酸，而另一个菌株专门进行下游转化，他们实现了从头合成超过 26 种不同的卤化分子，其中包括15 种首次合成的分子，以及6 种全新的自然界中不存在的分子。
▲图 | 利用下游酶的通用性生成广泛卤化色氨酸衍生产品的卤化产品多样化策略概述（来源：上述论文）
▲图 | 最终卤化色氨酸过生产菌株的示意图，展示了模块化工程。（来源：上述论文）
为了验证这种模块化共培养反应的有效性，他们比较了使用野生型色氨酸池生成的非卤化下游分子与共培养反应中形成的非卤化产品。结果显示，卤化色氨酸能轻易转化为相应的卤化色胺分子，同时非卤化色胺产品的量仅略有增加，从而验证了空间分离的有效性。紧接着，他们过模块化的、一锅式全新共培养反应，成功从葡萄糖原料生产了26 种不同的卤化分子。实验结果与喂养实验结果相吻合，突显了某些位置和酶的多效性。
综上所述，这项研究通过将组合化学和合成生物学的概念的结合，推动了卤化生物化学的新的发展，为生产多种功能性产品提供了绿色解决方案。
素材来源官方媒体/网络新闻
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