文/华中农业大学陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军
正文/4647字
预计阅读时间/12分钟
陈昌福有话说
当前正值草鱼投苗旺季，草鱼“三病”即将爆发流行，对此，养殖户们都早有应对措施。例如，广东中山黄圃草鱼苗产区早就普及了鱼苗出售前两针“自家疫苗”的做法，可以有效提高鱼苗免疫力，降低发病率，目前这种做法逐渐在全国全面推广。如何制作“自家疫苗”？如何接种？有何注意事项？以下方法仅供参考。
免疫预防是预防水产养殖动物疾病的三大措施之一。然而，迄今为止虽然我国农业农村部已经先后批准了7种鱼用疫苗，可以实施商品化制售。但是，由于鱼用疫苗的研制人员对用于制备这几种鱼用疫苗的病原性生物的抗原背景等问题，尚未研究清楚。因此，当水产养殖业者将我国的几种商品化鱼用疫苗，用于预防养殖鱼类疾病预防实践中后，其免疫防御效果是差强人意的。
为了避免鱼用疫苗因为出发菌株血清型存在差异，而导致疫苗免疫防御效果不佳的问题发生，多年来我们一直在呼吁我国鱼用疫苗，应该允许人们对“自家疫苗”的研制与应用。
从2020年开始，我们在辽宁省沈阳市辽中水产养殖区，从患细菌性败血症的养殖草鱼中分离、收集了大量的嗜水气单胞菌菌株后，利用血清学方法完成了对分离菌株血清型检测的基础上，筛选到抗原覆盖面广的适宜的疫苗出发菌株，制备成灭活的嗜水气单胞菌“自家疫苗”，作为预防细菌性败血症的鱼用疫苗，对养殖草鱼实施了免疫预防。几年的实践结果证明，取得了较为理想的免疫预防效果。
草鱼细菌性败血症
“自家疫苗”的研制与应用
摘要：从辽宁省辽中水产养殖区池塘养殖的患细菌性败血症的草鱼（Ctenopharyngodonidellus）体内分离致病性细菌，鉴定分离菌株所属种类并且对于嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的致病性菌株，采用血清学方法测定其血清型。根据分离菌株的血清型覆盖状况，筛选出制备A.hydrophila“自家疫苗”的出发菌株。将制备的A.hydrophila灭活疫苗添加在盛有定量养殖池水的容器中，使养殖水体种的灭活A.hydrophila疫苗浓度大到108cells/mL，再将平均体重为200.0g的草鱼鱼种，放在盛有灭活A.hydrophila疫苗水体的容器中，浸泡15min以实施浸泡免疫接种后，最后放入草鱼养殖池塘实施成鱼养殖。养殖结果证明，接种灭活A.hydrophila疫苗后，养殖受免草鱼未发生细菌性败血症，而且受免草鱼养殖成活率明显高于未接种灭活A.hydrophila疫苗的草鱼。
关键词：草鱼；细菌性败血症；嗜水气单胞菌；自家疫苗；免疫预防
细菌性败血症是严重危害养殖草鱼（Ctenopharyngodon idellus）的一种细菌性疾病。每年夏季我国淡水养殖鱼类均可能因为这种细菌性疾病的流行，而蒙受到重大的损失。细菌性败血症的致病菌已经被证实是嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），虽然我国农业农村部已经批准了一种A.hydrophila的鱼用疫苗，但是，可能是因为人们对这种致病菌的抗原性背景等尚未研究清楚，在我国不同水产养殖区域内应用这种疫苗后的预防疾病效果证明，对接种疫苗后养殖鱼类的免疫保护效果是差强人意的。
自2020年开始，为了避免因为疫苗出发菌株血清型的差异，造成A.hydrophila灭活疫苗失去对受免草鱼细菌性败血症的免疫预防效果，对从辽宁省沈阳市辽中区水产养殖区域内患病草鱼中收集的A.hydrophila菌株，利用检测分离菌株血清型的方法，筛选到适宜制作灭活疫苗的A.hydrophila菌株，制备成灭活的A.hydrophila疫苗后，对辽宁省沈阳市辽中水产养殖区域内的养殖草鱼实施了免疫接种，连续几年均获得了对草鱼细菌性败血症较好的免疫预防效果，现将试验结果报告如下。
01
材料与方法
1.1嗜水气单胞菌的来源
用于分离A.hydrophila的患病草鱼，取自辽宁省沈阳市辽中水产养殖区域内成鱼养殖池塘。从养殖池塘中捞取鱼体发黑、离群独游于池塘边上的患病草鱼，将活体带回实验室。在无菌条件下解剖鱼体后，从其肾脏和肝胰脏中取样，接种在盛有BHIA（Diffco）培养皿中。将接种好的培养皿，置于25℃恒温培养箱中培养48 h后，从培养皿中挑取单个菌落，转接于BHIA培养皿中，进行纯化培养48 h，将分离纯化的分离菌株，冷藏保存。
1.2分离菌株的鉴定
1.2.1根据菌株的16S rRNA鉴定
将从患病草鱼体内获得的分离菌株纯化培养后，寄送给生工生物工程（上海）股份有限公司，委托其检测分离菌株的16S rRNA。
1.2.2根据菌株的理化特性鉴定
按照《细菌鉴定手册》（第八版）和《常见细菌系统鉴定手册》的鉴定参数，分别对分离菌株，进行了理化特性鉴定。
1.3免疫原的制备
在制备的A.hydrophila菌液中定量添加0.02%的福尔马林，放置与28.0℃恒温培养箱中，放置24 h后进行灭活后，即为福尔马林灭活A.hydrophila菌液。取灭活后的菌液100.0µL，分别接种在培养皿中，置于28.0℃恒温培养箱中，放置24 h后进行观察，培养皿中无菌落长出，即证明菌体已经被彻底灭活，即作为灭活A.hydrophila疫苗（免疫原和反应原）使用。
1.4免疫接种
对每尾平均体重为100.0g的健康草鱼，经胸鳍基部注射0.25mL灭活A.hydrophila疫苗后（图1），每个菌株制备的灭活A.hydrophila疫苗接种30尾健康草鱼。将免疫接种后的草鱼放回水族中，采用经过曝气自来水充气饲养，每天分早、晚各投喂1次草鱼人工配合饲料。饲养期间，水族箱中的水温变化在22~28℃之间。
图1对体重100.0g健康草鱼注射灭活A.hydrophila疫苗
1.5采血
自免疫接种灭活A.hydrophila疫苗后，将供试鱼在水族箱中饲养28 d后，从每一个试验和对照组水族箱中随机捞取10尾供试草鱼，采用注射器刺穿尾动脉和切断腹主动脉的方法采血（图2）。采集的血液盛装在玻璃试管中，首先在室温下放置2.0 h，待其血液凝固后将盛血液试管移放入4.0℃冰箱中过夜，让凝血块进一步收缩后，用离心法分离草鱼免疫血清，冷藏备用。
图2用注射器刺穿受免草鱼尾动脉法采血
1.6抗体效价的测定
免疫血清中凝集效价的测定采用血凝板法进行（图3）。用于凝集反应的反应原除了用 作本研究中免疫原的灭活A.hydrophila疫苗外，还有从患病草鱼中分离的A.hydrophila，并经过福尔马林灭活的分离菌株制备的灭活菌体。
图3采用凝集板法检测免疫血清中的凝集抗体效价
1.7浸泡免疫接种
在每年的4月中旬左右，当养殖池塘水体温度达到11.0℃以上时，对投放的草鱼鱼种实施浸泡免疫接种。即将制备的灭活A.hydrophila疫苗，添加在盛有定量养殖池水的容器中，使养殖水体中的灭活A.hydrophila疫苗浓度达到108cells/mL，再将平均体重约为200.0g的草鱼鱼种，放在盛有灭活A.hydrophila疫苗水体的容器中，浸泡15min以实施浸泡免疫接种后，再放入草鱼养殖池塘实施成鱼养殖。
1.8免疫防御效果观察与评价
因为免疫接种灭活A.hydrophila疫苗后，是实施草鱼成鱼阶段的养殖。因此，免疫防御效果的观察与评价，是针对辽宁省沈阳市辽中水产养殖区域内，实施免疫接种的养殖池塘中养殖草鱼的发病与养成情况，将未实施免疫接种的养殖池塘中养殖草鱼的发病与养成情况做对照，完成的观察与评价。
02
结果
2.1致病菌分离菌株数量与鉴定
2019年~2023年，先后从患病草鱼中共分离纯化到239个分离菌株。其中有128个分离菌株鉴定为A.hydrophila。
2.2灭活疫苗出发菌株的筛选
根据对分离A.hydrophila菌株在免疫血清中凝集效价的测定结果，选择分离菌株之间交叉凝集效价最高的A.hydrophila菌株，作为每年制备灭活A.hydrophila疫苗的出发菌株。2020年选定的分离菌株编号为LCP190711-2；2021年选定分离菌株编号为LCS200605-1；2022年选定的分离菌株编号为LCS210802-1；2023年选定的菌株编号为LCS220509-1。
2.3免疫防御效果
实施浸泡免疫接种灭活A.hydrophila疫苗后，进行的草鱼成鱼阶段的养殖。将实施免疫接种后养殖池塘中养殖草鱼的发病与养成情况，与未实施免疫接种的养殖池塘中养殖草鱼的发病与养成情况做对比，2023年完成免疫接种的免疫效果抽样观察与评价情况如表1。由表1结果所示，经过浸泡免疫接种灭活A.hydrophila疫苗的草鱼成活率，较未经接种灭活疫苗的对照池塘中草鱼成活率高，养殖期间未发生细菌性败血症。
表1 2023年浸泡免疫接种灭活A.hydrophila疫苗草鱼与对照池塘养成情况的对比
3
淡水鱼类细菌性败血症是由气单胞菌属（Aeromonas）的几种细菌引起的。本研究的结果证实，从辽宁省沈阳市辽中水产养殖区域患细菌性败血症草鱼体内分离的大部分菌株，均属于A.hydrophila，只有少数的属于温和气单胞菌（A.sobria）等。
养殖鱼类的细菌性败血症具有发病急、死亡率高的特点，一旦疾病暴发性地发生于流行起来，就很难有效地控制这种疾病造成的经济损失了。对于养殖鱼类细菌病的防控主要有两条途径，即药物防控与免疫防控。在我国“国标渔药”中，虽然有几种抗微生物药物是被允许用于养殖鱼类细菌性疾病治疗的。但是，由于长期以来没有关于水产养殖动物致病菌对抗微生物药物敏感性的监测数据，导致水产养殖业者在采用抗微生物药物治疗草鱼细菌性败血症时，也难以做到科学、精准地使用抗微生物药物，治疗疾病的效果也就大多是难以期待的。农业农村部虽然已经批准了一种灭活A.hydrophila鱼用疫苗，但是，因为多种原因导致该疫苗的免疫防御效果比较差，这种鱼用疫苗至今也尚未得到广泛地推广应用。
本研究正是有鉴于草鱼细菌性败血症防控中存在的上述问题，在从患病草鱼体内分离致病性菌株后完成药物敏感性测定，采用适宜的抗微生物药物和剂量治疗患病草鱼细菌性败血症，显著地提高了药物治疗患病草鱼的细菌性败血症。与此同时，利用从患病草鱼中分离、纯化的致病性菌株，利用血清学技术研究分离菌株的血清型、了解灭活A.hydrophila疫苗免疫原性和抗原性差异，从中筛选制备“自家疫苗”的适宜菌株，研制能用于辽宁省沈阳市辽中水产养殖区域的“自家疫苗”，因为成功地避免了制备灭活A.hydrophila疫苗的出发菌株，与引起草鱼细菌性败血症致病菌株之间，可能存在的因为血清型不同而造成的抗原性差异等，因此提高了这种“自家疫苗”预防养殖草鱼细菌性败血症的免疫防御效果。
转载声明
本文版权属于南方农村报 、农财宝典 大国渔业，未经授权，谢绝转载。
作者：华中农业大学陈昌福；武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军。
编辑：郑燕云
水产人为“大国渔业”加油！