正畸牙齿移动（OTM）期间产生的机械刺激包括拉伸和压缩应变，它们触发牙周膜成纤维细胞（PdLFs）的力特异性机械生物学反应，为组织和骨重塑创造有利的微环境。拉伸力通过增加抗炎IL-10的分泌和刺激成骨细胞分化来促进骨形成。由于PdL成纤维细胞分化为成骨细胞的内在潜力，在施加拉力时检测到碱性磷酸酶（ALP）和runt相关转录因子2（RUNX2）等成骨标志物的表达以及钙沉积物的增加。相反，压缩力通过PdLFs诱导缺氧和促炎细胞因子，包括IL-6、IL-8、PGE2以及RANKL的分泌来促进骨吸收微环境。
作为一种应激响应型多功能调节因子，最近发现生长分化因子15（GDF15）在PdLFs对压缩力的机械反应中是重要的促炎调节剂。细胞外GDF15可以与细胞膜受体结合，此外，激活素受体样激酶（ALK）家族的成员也结合GDF15并介导自分泌和旁分泌功能。除了其受体介导的信号转导外，据报道，未经处理的GDF15在易位到细胞核后也能调节基因表达。
考虑到GDF15在PdL成纤维细胞机械反应中的关键作用，长期暴露于GDF15可能会损害其功能，从而增加这些患者在正畸治疗中的风险。GDF15已被证明可以调节成骨细胞的分化和功能，从而可能改变细胞命运和PdLFs的机械反应，这之间似乎特别相关。因此，德国耶拿大学附属医院口腔正畸科的研究员在一项实验中探讨了长时间暴露于GDF15对PdL成纤维细胞特性和机械生物学功能的影响。研究成果发表在InternationalJournal of Molecular Sciences 期刊题为“GDF15Promotes the Osteogenic Cell Fate of Periodontal LigamentFibroblasts, thus Affecting Their Mechanobiological Response”。
首先，为了评估长时间暴露于GDF15对hPdLFs的影响，分析了两种浓度的重组人GDF15（rhGDF15：5ng/mL；20ng/mL）刺激12、24和36天后的代谢活性（图1d），发现12天的刺激导致代谢活性降低，这种降低随着刺激时间的延长而持续。
随后确定细胞密度（图1e、f），刺激12天后，细胞密度显著降低，且随着暴露时间的增加而变得更加明显，但与应用的rhGDF15浓度无关。为了确定增殖细胞的比例，在rhGDF15暴露12、24和36天后对增殖标志物Ki-67进行免疫荧光染色（图1e、g）。在所有条件下，观察到Ki67阳性细胞的比例降低，这可能是由于空间有限导致生长衰老或诱导的分化程序。在任何分析的时间点均未检测到所应用的两种rhGDF15浓度之间的显著差异。
由于GDF15被报道会影响细胞存活，因此还使用台盼蓝染色（图1h）TUNEL测定法（图1i、j）分析了受损细胞的比例。然而，既没有检测到与培养持续时间相关的细胞存活变化，也没有检测到由暴露于rhGDF15引起的变化。
这些数据表明，GDF15限制了hPdLFs的增殖能力，而不影响细胞存活。
由于细胞存活不受影响，hPdLFs增殖减少可能是由细胞衰老或成骨分化增加引起的，这两者都可能受到GDF15的影响。对早期衰老标志物p21的免疫荧光染色强度进行定量分析显示，在两种浓度rhGDF15刺激12天和24天后，其表达水平显著升高，在刺激的最高时间点无法检测到这种增加。这表明，rhGDF15刺激12天后，细胞衰老激活增强，而长时间暴露后没有观察到显著变化。
接下来，实验旨在解决GDF15的成骨分化和潜在改变，这可能是除衰老外，刺激hPdLFs增殖能力降低的重要因素。对成骨标志基因ALPL和RUNX2进行定量表达分析，结果显示，其在rhGDF15暴露12天和24天后水平升高（图2a、b）。作为成骨分化特征的碱性磷酸酶活性的进一步分析清楚地表明，其在rhGDF15暴露36天后水平升高（图2c、d）。值得注意的是，RNA转录水平不一定与各自的蛋白质水平相关，翻译后调控可能还会额外调节蛋白质活性。
考虑到ALP活性对矿化至关重要，研究员进一步分析了钙沉积的形成，作为rhGDF15刺激36天时成骨细胞活性的标志物（图2e、f）。结果观察到，在rhGDF15的长期刺激下，矿化沉积物的形成略有增加，但似乎也与浓度无关，然而，在成骨分化对照中这一增幅明显更高。
这些数据表明，GDF15在长期暴露后促进hPdLFs的成骨分化，而细胞衰老随着刺激时间的缩短而更加突出。
在后续研究中，实验旨在确定通过36天的长时间rhGDF15暴露向成骨细胞命运的转变在多大程度上影响了对机械刺激做出反应的hPdLFs的功能。为此，应用双轴拉伸力（15.9%），抗炎标志物IL-10（图3a）和IL-1RA（图3b）水平升高，并没有因先前长期暴露于rhGDF15而产生相关的变化。然后分析贴壁THP1细胞，通过确定单核免疫细胞的激活来可视化炎症反应（图3c、d），发现虽然拉伸力促进了抗炎反应，减少了THP1的激活，但先前的rhGDF15暴露阻断了这种反应。
由于骨形成和成骨细胞活性的激活是拉伸部位的关键特征，因此进一步分析了双轴拉伸应力24h 后hPdLFs中ALP活性的诱导（图3e、f）。虽然对照组由于施加拉伸力而显示出增加的ALP活性，但在rhGDF15刺激的hPdLFs中没有检测到这一点，这表明拉伸应力对进一步成骨细胞的激活有限。值得注意的是，由于基线水平增加，rhGDF15暴露下拉伸刺激的hPdLFs中的ALP活性仍显著高于应力对照细胞（图3f）。此外，还研究了施加拉伸应力后钙沉积的形成（图3g、h）。虽然先前检测到的GDF15-依赖性钙沉积形成的增加在力应激细胞中也被检测到，但与未刺激的hPdLFs相比，对照培养组和rhGDF15-刺激的hPdLFs组都没有显示出与拉伸力相关的差异。
基于其在调节对压缩刺激的促炎反应中的关键作用，最后，实验研究了先前的长期暴露对压缩应力（2g/cm2）下hPdLFs机械反应的影响。压缩力促进hPdLFs的促炎反应，并通过增加RANKL水平和激活破骨细胞来促进骨降解。
对促炎细胞因子IL-6和COX2（图4a、b）进行定量分析，虽然没有检测到GDF15依赖性的COX2表达，但在压缩力下的rhGDF15刺激的hPdLFs中IL6水平显著增加。值得注意的是，基线水平不会随着rhGDF15暴露而改变。为了研究IL6表达的变化是否也会导致炎症反应的改变，从而导致免疫细胞的激活，研究相应地分析了THP1单核细胞的粘附（图4c、d），发现rhGDF15长期刺激期间压缩力刺激的hPdLFs对单核细胞的激活增加。
通过分析应力刺激下的hPdLFs的RANKL和OPG表达，重点关注对骨吸收破骨细胞激活的可能影响（图4e、f）。在对照组中，压缩力促进了RANKL水平的显著增加和OPG水平的显著降低，在这种情况下，通常通过增加RANKL-RANK结合来促进破骨细胞分化。然而，在rhGDF15刺激的hPdLFs中没有观察到这些变化。
为了进一步解决破骨细胞激活在功能上的变化，将预刺激的THP1单核细胞产生的巨噬细胞用压缩应力刺激的hPdLFs的培养上清液培养（图4f、g）。与未受压缩应力的对照组相比，压缩对照成纤维细胞的培养基上清刺激后，检测到向单核前破骨细胞和成熟多核破骨细胞的分化增强。然而，与RANKL和OPG表达数据一致，在广泛暴露于rhGDF15的压缩hPdLFs中观察到破骨细胞活化减少。
这些数据表明，GDF15的长期刺激对人PdL成纤维细胞的细胞特性和促炎机械生物学反应具有相关影响，导致由于压缩力诱导的炎症增加，但破骨细胞活化减少，可能是通过调节RANKL/OPG。
总之，该研究结果强烈表明，GDF15对PdL成纤维细胞的细胞命运具有相关影响，从而在较长的时间内促进成骨分化。此外，GDF15似乎影响这些细胞的力相关炎症机械反应，并随后影响它们对破骨细胞的激活。由于研究使用简化的体外加载模型来模拟具有压缩和拉伸应变的正畸牙齿移动，因此未来的研究应侧重于体内的这些发现。总而言之，以上研究提供了证据表明，长期升高的GDF15水平（例如与特定疾病和衰老相关的水平）确实会影响PdL细胞的机械反应性，因此可能与这些患者的正畸治疗有关。
参考文献：LöschL, Stemmler A, Fischer A, Steinmetz J, Schuldt L, Hennig CL, SymmankJ, Jacobs C. GDF15 Promotes the Osteogenic Cell Fate of PeriodontalLigament Fibroblasts, thus Affecting Their MechanobiologicalResponse. Int J Mol Sci. 2023 Jun 11;24(12):10011. doi:10.3390/ijms241210011. PMID: 37373159; PMCID: PMC10298702.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37373159/
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