近年来，一些新技术和新方法正在逐步改变检验医学的面貌。如基因测序技术的迅猛发展使得我们能够以前所未有的速度和精度解析遗传信息，纳米技术的应用则让检测设备更加微型化、智能化，而基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术则为疾病诊断和治疗提供了新的可能。此外，生物传感器、微流控芯片、液体活检、单细胞分析等前沿技术也在持续推动着检验医学的发展。
今天，检验君为大家分享的是重庆医科大学检验医学院谢国明教授团队近期关于检验医学快速精准检测新方法与技术的研究前沿。
动态DNA组装新方法
生物系统的结构是动态变化的，如细胞骨架中的微管，它们不断地组装和拆卸以响应环境变化。这种动态性启发了科学家们开发出能够在非平衡状态下工作的人工动态结构。DNA纳米技术作为这一领域的前沿，已经发展出多种可编程的自组装系统和动态反应网络，为构建具有生物活性的纳米器件和响应性自组装系统提供了可能。
近日，重庆医科大学邓世雄教授、谢国明教授团队开发了一种模拟微管蛋白的可编程杂交链反应（MD-HCR）技术，用于动态DNA组装。该研究发表在Nano Letters（IF:10.8）。
文章详细介绍了DNA纳米技术在构建可编程自组装系统和动态反应网络方面的进展，这些技术在构建响应性生物材料方面具有巨大潜力。研究者们通过引入亚稳态结构域（MD）到DNA发夹中，设计了一种新的可编程杂交链反应（MD-HCR），这种反应可以实现DNA纳米结构的动态组装和拆卸。
该研究涵盖了MD-HCR的设计原理、动力学控制、可逆构象调节以及级联控制等方面。通过实验和模拟，该研究展示了如何通过改变MD和spacer的长度来调节HCR的延伸速率，以及如何通过Invader和Anti-invader的循环来实现MD-HCR的可逆组装和拆卸。此外，文章还探讨了MD-HCR在动态调节酶活性方面的应用，展示了其在模拟自然代谢和调节细胞代谢方面的潜力。
该研究不仅为动态编程响应性DNA纳米结构提供了一种新的工具，也为未来构建具有模式识别、模式形成和自我修复能力的人工细胞提供了新的思路。研究者们期待DNA纳米技术能够发展出类似于生物分子燃料的“ATP等价物”，并相信MD-HCR的设计可以激发人工系统中自主生物功能更复杂的分子设计的发展。
文章链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.3c04852
基于可移动Toehold策略的低泄漏自组装系统，让信息传递更高效
DNA作为一种强大的工程材料，其自然属性使得基于Toehold介导链置换反应的核酸电路在多个领域有着广泛应用，如无酶、高效、等温的催化发夹组装法（CHA）。然而，无酶放大器的主要障碍之一是在没有入侵链的情况下误触发扩增级联，即电路泄漏，这也限制了相关工具进一步设计与开发。
日前，重庆医科大学检验医学院谢国明教授、吕科博士，西南医科大学附属中医医院郭永灿教授团队提出了一种可移动Toehold策略，并以此构建低泄漏的、更特异的mtCHA电路，让信息传递更准确、更高效。该研究发表在Biosensors and Bioelectronics（IF:12.6）。
该研究在系统地分析CHA反应的泄漏途径后，绕过发生泄漏的DNA双链部分，直接截短具有入侵倾向的发夹Toehold区域，达到即使双链部分发生呼吸、也很难入侵至有效的启动长度发生链置换反应，从而降低泄漏的效果。同时，研究人员推测降低Toehold的长度降低泄漏反应速率的同时大概率会导致目标反应速率的降低。
为了补偿这种效果，该研究将截短的发卡Toehold片段转移至催化链中以加速反应，构建可移动的Toehold策略，并将以此为基础的发卡自组装称为mtCHA，在降低泄漏的同时保证催化反应反应性，最大程度提升信噪比。且成功验证mtCHA良好的鲁棒性、特异性。其在邻近识别、小分子信号放大、逻辑电路、自催化反应、级联放大电路中也表现出不错的效果。
总之，该研究提出了一种可移动Toehold策略，并以此构建低泄漏的、更特异的mtCHA电路，有助于CHA电路更广泛地应用。此外，这种将泄漏罪魁祸首转变为催化助剂的方法有望为解决其他系统的泄漏问题提供新的思路。
文章链接：
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0956566323007650
增强DNA电路构建和多功能转导的空间可控邻近分裂镊子开关
DNA链置换反应在动态核酸纳米技术领域扮演着重要角色。但仅有少数方法能够消除不必要的电路泄漏，这显著阻碍了复杂级联和分层DNA网络的构建。
日前，重庆医科大学检验医学院谢国明教授团队提出一种用于空间控制的通用邻近分裂镊子（PST）开关策略，实现了从生物分子到所需寡核苷酸的多功能转导。该研究发表在Small（IF:13.3）。
该研究证明了纳米镊子的双链刚性与发夹锁的阻碍效应相协同，最大程度地减少了DNA电路的泄漏。此外，由于目标结合位点的序列与SDR域完全独立，可以轻松地适应广泛的靶标。利用这一概念，该平台成功地实现了核酸、小分子和蛋白质的转导。更重要的是，该研究在核酸和非核酸分子之间建立了桥梁，有效构建了不同类型靶标之间的逻辑操作（AND、OR和INH门）。此外，该转导系统可以直接与HCR催化电路相结合，进一步放大目标转导性能。
该研究依赖于空间控制的PST开关，可将生物分子多样地转导为所需的寡核苷酸。与关注结合区域长度、组成和spacer的传统序列级方法不同，该PST开关利用了镊子的双链刚性和发夹锁的阻碍效应，能够有效减少电路泄漏。由于输出链的序列完全独立于靶结合位点，该平台允许通过核酸、小分子和蛋白质调节PST开关的构象，表现出对广泛靶标的显著适应性。
研究人员表示，该平台的独特之处在于其设计简单、灵活性强、可扩展复杂性且系统兼容性好。这些特点将为基于核酸的复杂转导网络的开发铺平道路，或可在基础科学研究和生物医学研究中得到广泛应用。
文章链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202307421
串联或并联Toehold介导的链置换及其在环形RNA检测和逻辑门中的应用
核酸杂交与许多生物学过程和技术应用有关。核酸的二级结构可以导致异常的生物功能，也可以在蛋白质识别和确定复制起源方面发挥着重要作用。Toehold介导的链置换（TMSD）被广泛用于构建广泛的化学反应网络。但在现有的TMSD技术中，处理具有二级结构的靶标时存在局限性，单链DNA或RNA可以自身折叠形成局部短双链结构，通常会阻碍双分子杂交。
日前，重庆医科大学检验医学院谢国明教授团队开发了一种串联（STMSD）或并联Toehold介导的链置换（PTMSD）策略，与现有的链置换调控工具具有良好的兼容性，并对单碱基错配或circRNA具有很强的选择性。该研究发表在Biosensors and Bioelectronics（IF:12.6）。
研究人员在具有不同核酸二级结构的三种模式中探索了这种策略。反应速率可以通过改变两个Toehold的长度在三到五个数量级范围内进行调节。这种方法与现有的链置换调控工具具有良好的兼容性，并对单碱基错配或circRNA具有很强的选择性。同时，研究人员建立了逻辑运算系统来说明串联和并联立足点策略的强大功能。
与其他强调速率调节的机制不同，串联和并联立足点专注于触发和控制涉及到具有二级结构的目标的链置换反应。该研究表征了STMSD和PTMSD的动力学，并引入了一个简单的模型来预测反应速率常数。STMSD和PTMSD可以通过改变两个Toehold的长度来触发和控制具有不同二级结构的核酸链置换反应。此外，STMSD与现有的调节工具具有良好的兼容性，可用于区分circRNA和线性RNA，以及构建各种逻辑门。
研究人员表示，STMSD和PTMSD策略为基于DNA的分子运算和分子机器人技术的进步提供了新的可能性，尤其是在构建细胞水平的分子计算机和生物传感器方面具有广泛的应用潜力。
文章链接：
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S095656632300619X
CRISPR/Cas12a性能调控研究前沿
CRISPR的革命性技术深刻改变了分子生物学领域。然而，随着应用范围的不断扩大，仅凭CRISPR/Cas的固有性能已不足以满足越来越多细分应用的多样化需求。如何精细调控CRISPR/Cas的多项性能以更好地满足不同的需求逐渐成为研究的重点。
日前，重庆医科大学检验医学院谢国明教授、陈婷梅教授、吕科博士团队提出一种无修饰的CRISPR/Cas12a多种性能无级调控策略，可实现对多种CRISPR/Cas12a特性的细粒度和可预测控制。该研究发表在Nucleic Acids Research（IF:14.9）。
该研究在CRISPR/Cas12a体系中引入了基于TMSD的额外RNA附件（ERA）工具包，这些ERA不会激活Cas12a，但能与crRNA的部分space区域结合形成具有toehold的双链结构，让激活剂与crRNA的简单配对结合转变为由TMSD决定的有条件的反应（ERA作用等同于“protecter”）。通过附加不同长度，不同结构，不同错配的ERA能相应地改变ERA-crRNA复合物与激活剂反应的动力学和热力学，从而允许精确地控制Cas核酸酶的激活程度，进而允许掌控包括活性、速度、特异性、编程性、拓展性、灵敏度等多项性能。
此外，通过附加ERA实现了空间连续而时间隔离的CRISPR激活控制，从而克服了等温一锅法检测中CRISPR/Cas信号输出模块与扩增模块的互斥难题，进一步提高了等温一锅法检测的灵敏度和信噪比，展现了精细控制CRISPR性能的巨大潜力。
总之，该策略消除了对Cas蛋白或crRNA组分进行修饰的需要，利用核酸纳米技术的强大可编程性，基于可定制的ERA工具箱，实现对多种CRISPR/Cas12a特性的细粒度和可预测控制，能够满足快速发展和精细划分的分子生物学领域更加多样化和细致的需求。
文章链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37757856/
用于多位点SNP远距离分布分析的临床检验诊断学新方法
在第二代测序技术和荧光PCR技术的支持下，SNP的快速分析已经在速度、成本、灵敏度、特异性方面都取得了成功。然而可能具有更加丰富医学和遗传学信息的单倍型的快速分析技术却发展缓慢，具有挑战性。
日前，重庆医科大学检验医学院谢国明教授、吕科博士，西南医科大学附属中医医院郭永灿教授团队的一项研究结合DNA纳米技术，开发了一套完整而系统的模块化算法，有效地分析了多位点长距离单倍型组合，开发更有效的单倍型分析技术提供了新思路。该研究发表在Chemical Engineering Journal（IF:15.1）。
该研究设计了能够保留模块化单倍型信息，含有特异性杂交位点，具有长链稳定性的双toehold长双链靶标（DT-LDT）；通过DNA纳米技术，开发了基于Holliday-junction的纽扣探针（BP），能够在无法完全链置换的逆境下特异性鉴别比自身更长的双链靶标；通过对核酸结合的热力学机制探索，克服了可逆探针的特异性和产率冲突，显著提高了检测效率；通过数学逻辑推理，设计了“两点一线”模块化算法来将困难的多位点远距离SNP分析简化为多个模块信息的整合分析。
此外，探针-靶标复合物的检测并不局限于流式细胞仪，电化学平台、ELISA平台或其他夹心方法都可能取得更好的效果。研究人员表示，这种“两点一线”策略可以启发开发更有效的单倍型分析技术。
文章链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1385894723047575?via%3Dihub
40分钟内即可实现基因分型的免提取一步法
环介导等温扩增（LAMP）因其快速、灵敏、特异性和更简单的仪器而成为现场检测核酸的PCR的常用替代方法。虽然双标记TaqMan探针广泛用于PCR中的SNP基因分型，但实时LAMP主要依赖于浊度法或插入物荧光测量，这是非特异性，并可能产生假阳性结果。
日前，重庆医科大学检验医学院谢国明教授、西南医科大学附属中医医院郭永灿教授团队的一项研究提出了一种用于SNP基因分型的封闭管、双标记RNA修饰探针和RNase H II辅助实时LAMP（RART-LAMP）方法，仅需30分钟即可完成对gDNA的检测。该研究发表在Analytical Chemistry（IF:7.4）。
RART-LAMP方法荧光信号主要来源于探针水解而非杂交，探针和模板之间的温度控制杂交确保了SNP分析的特异性，以及含有SNP位点的靶标和探针之间的RNase H II水解不表现出序列特异性。该方法在C677T临床样本的基因分型中表现出了优异的性能，包括从血液、唾液和拭子中提取的gDNA。
此外，该研究所构建的RART-LAMP方法可以在30-40 min内实现唾液和拭子样本的直接检测，而样本无需任何预处理。该方法“样品进、结果出”的一步法检测方式赋予了更强的POCT能力，未经培训的人员也可以很容易地在资源有限的现场环境中应用。
研究人员表示，在接下来的工作中，他们将更加专注于开发具有SNPs特异性的RNA水解酶和更特异性的检测探针，以提高其性能。
文章链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.3c02232
专家简介
谢国明 教授
重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室副主任，医学检验微流控与SPRi重庆市工程中心学术带头人，重庆医科大学特聘教授，博士生导师、博士后合作导师。University of Nevada, Las Vegas和University of Illinois at Urbana-Champaign访问学者。
国家科技奖评审专家，国家自然科学基金评审专家，国家科技部重大专项评审专家，重庆市科技项目评审专家，国家教育部学位论文评审专家，重庆市体外诊断技术创新战略联盟第一届专家委员会副主任委员，重庆医科大学教育发展基金会理事。《分析仪器》杂志编委，Biosens.Bioelectron.X杂志客座编辑。
研究方向：临床分子检验与DNA动态纳米技术、液体活检与微流控芯片、POCT与生物传感器研究与开发。近5年主持2022年国家重点研发计划课题1项、2019年、2021年和2023年国家自然科学基金面上项目3项，2018年和2021年重庆市科技项目2项。在Nucleic Acids Research、Journal of the American Chemical Society、ACS Nano、Nano Letters、Small、Analytical Chemistry和Chemical Communications等杂志上发表SCI收录论文50余篇。获得2021年“四川省科学技术进步三等奖”1项。
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编辑：唐强虎 审校：方琪