钠葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）恩格列净（EMPA）已被批准用于治疗心力衰竭，因为它对伴和不伴糖尿病患者的心血管均有益处。EMPA对心血管的保护作用可能部分解释为其对内皮细胞（ECs）的直接作用。
EMPA在 ECs中显示出强大的抗氧化作用。活细胞图像显示，在TNF-α 刺激的静态人ECs 中，EMPA抑制 ROS的产生并恢复 NO生物利用度。最近，研究首次发现SGLT2i 还能抑制暴露于10%拉伸应力下的人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）中ROS的产生和细胞通透性的增加，揭示了EMPA对动态培养的ECs也发挥保护作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）1/4抑制剂GKT136901 降低了10% 拉伸应力下ECs 中的ROS，其程度与EMPA 相似，且与EMPA 联合使用时对ROS 降低能力也不会增强，这支持NOX 作为关键介质参与EMPA 的抗氧化作用。
暴露于TNF-α 和循环拉伸会增加ECs和心肌细胞中钠氢交换体（NHE）的活性，导致细胞内钠（Na+）增加。据推测，Na+通过钠钙交换体（NCX）增强胞质Ca2+ 来触发ECs 内ROS 的产生，从而刺激Ca2+依赖性蛋白激酶C（PKC）亚型。PKC活性升高，尤其是 PKC-β，在人ECs 的NOX 活化和ROS产生中起主导作用。先前的研究表明，SGLT2i直接抑制 NHE，并且用EMPA 或Cariporide（NHE抑制剂）降低NHE 活性可抑制受到增强的拉伸和TNF-α 刺激的人ECs 中ROS 的产生。然而，EMPA对细胞内 Ca2+和 PKC活性的影响在这些研究尚未调查。
最近，在荷兰阿姆斯特丹大学医学中心及德国石勒苏益格-荷尔斯泰因大学麻醉学与重症监护医学系联合课题组的一项研究中，假设EMPA 通过阻止PKC 激活来抑制拉伸诱导的NOX 活化和ROS生成。研究人员旨在探讨PKC在拉伸刺激的ECs 中参与EMPA 降低ROS 的作用，以及EMPA 抑制PKC 的上游信号通路。研究成果发表在Redox Biology期刊题为“Empagliflozinprevents oxidative stress in human coronary artery endothelial cellsvia the NHE/PKC/NOX axis”。
首先，将HCAECs暴露于4或24小时循环拉伸（1Hz）下，5%的拉伸幅度作为生理对照，10%幅度是损伤模型。与 5%拉伸相比，10%拉伸增加了 HCAECs中的 PKC活性（图1B），1μM EMPA 和 10nM LY-333531（PKCβ抑制剂）完全还原了 PKC活性（图1B ）。EMPA和 LY-333531均可阻止 10%拉伸下 HCAECs中 NOX活性，但两种药物的联合治疗不能增强这种活性（图1C）。这些数据表明，EMPA通过抑制 10%拉伸下的 HCAECs中的 PKC活性来抑制 NOX激活。
EMPA和 LY-333531均降低了 10%拉伸诱导的 ROS生成，联合处理无额外效果（图1D）。LY-333531恢复了 10%拉伸后细胞VE-钙黏蛋白的丢失和通透性的增加（图1E、F）。免疫荧光染色显示，10%的拉伸显著破坏了由VE-钙粘蛋白形成的细胞间连接，而LY-333531 可以阻止这种破坏（图1G）。这表明，EMPA可以防止由 10%拉伸引起的细胞通透性破坏。当LY-333531 与EMPA联合使用时，其内皮保护作用没有进一步被放大，说明这两种化合物具有相似的保护机制（图1E、F）。这些数据表明，EMPA通过抑制 PKC活性来降低 10%拉伸下内皮细胞中增加的ROS 生成和细胞通透性。
此外，10nM PKC 激活剂 PMA刺激了 5%拉伸下 ECs中 ROS的产生，表明 PKC是 HCAECs中氧化应激的关键介质之一。GKT136901的应用完全消除了 NOX活性的增加，证明 NOX1/4是促进拉伸下 ECs中 NOX活化的主要亚型。
以上数据表明，EMPA通过抑制 PKC活性改善拉伸诱导的内皮功能障碍。
为了探究HCAECs 中胞质Ca2+ 和氧化应激的功能关系，应用0.2 μM 离子霉素（IONO）增强细胞内Ca2+，并激活内皮细胞中的PKC。使用特异性siRNA 转染可使PKC-β 表达降低80%，这有效地消除了接收IONO 的HCAECs 中NOX 活性和ROS 产生的增加。此外，PKC-β敲低阻断了 10%拉伸下 NOX的活化，表明 PKC-β是拉伸相关氧化应激的介质。
在静态HCAECs 中，EMPA、NCX抑制剂 ORM-10962和钙螯合剂 BAPTA-AM降低了细胞内 Ca2+，EMPA和 NCX抑制剂 ORM-10962的联合使用未导致 Ca2+的进一步降低（图2A），表明 EMPA可能通过抑制 NCX在HCAECs中降低 Ca2+。在暴露于10% 拉伸的细胞中，BAPTA-AM和 ORM-10962都阻止了由 10%拉伸诱导的增强的 PKC活性和氧化应激（图2C、D、E）。此外，BAPTA-AM和 ORM-10962都恢复了 10%拉伸后增加的细胞通透性。BAPTA-AM阻止了 10%拉伸下 HCAECs中 VE-钙粘蛋白的破坏，提示细胞内Ca2+是拉伸相关内皮屏障功能障碍的中介。进一步验证NCX1 作为拉伸相关PKC激活的中介作用，结果表明，NCX1的敲低阻止了由10% 拉伸引起的PKC 活性的增加。
上述数据表明，EMPA可能会通过 NCX降低细胞内 Ca2+，导致10% 拉伸下HCAECs 中的PKC 活化和氧化应激的抑制。
NHE抑制剂 Cariporide阻止了 10%拉伸诱导的 PKC活性增加，与 EMPA联合使用时对 PKC抑制作用没有增强。与单独使用Cariporide 相比，和EMPA 的联合对拉伸增强的NOX活性具有相似的抑制能力。进一步的实验表明，钠泵抑制剂哇巴因（ouabain）有效上调暴露于5% 拉伸下HCAECs 中ROS 的产生。这表明，EMPA通过抑制 NHE/Na+通路抑制拉伸诱导的 PKC活性和 NOX活化。
最后，实验研究了HCAECs 中EMPA 是否通过抑制NHE 活性和减少胞质Na+ 来降低细胞内Ca2+ 。Cariporide可降低静息 ECs中 Ca2+（图3A），揭示了人 ECs中 NHE活性降低与细胞内 Ca2+降低之间的因果关系。令人惊讶的是，Cariporide与 EMPA的组合比单独使用 Cariporide发挥了更有效的 Ca2+抑制作用。
为了探究HCAECs 中NHE1、胞质Na+ 和NCX1 在Ca2+ 动员中的相互作用，在Cariporide 或Ouabain 存在下，在NCX1敲低细胞中测量 Ca2+。NCX敲低导致接受 Cariporide的 HCAECs中 Ca2+的进一步减少（图3D），而 NHE抑制剂没有降低 Ca2+。此外，NCX敲低完全消除了由 Ouabain引起的细胞内 Ca2+的增强（图3E），表明累积的胞质 Na+通过 NCX可以触发细胞内 Ca2+的增加。这些数据表明，EMPA可能通过抑制 Na/NCX轴降低胞质 Ca2+，这种作用部分由NHE 介导。
值得注意的是，目前的研究显示10% 拉伸或EMPA 对PKC-β、NOX4、NCX1和 NHE1的 mRNA和蛋白质水平没有显著影响，这表明EMPA的内皮保护作用不是由这些基因表达的变化介导的。
EMPA通过抑制NHE/Na+/NCX轴降低细胞内Ca2+，进而阻止10%拉伸诱导的PKC活性和NOX活化，并抑制ROS的产生。
总之，该研究证明了，在机械力作用下HCAECs 中EMPA 对PKC 抑制的新作用，这也可能是解释观察到的SGLT2i对暴露于不同病理刺激（例如高血糖、炎症细胞因子、循环拉伸）的细胞的抗氧化作用的主要途径。使用机械激活的HCAECs，研究进一步表明，EMPA通过 NHE和 NCX等离子通道调节细胞内离子稳态（例如Na+和Ca2+）有助于改善内皮功能障碍。这些发现提高了关于SGLT2i 对心血管益处的理解。
参考文献：LiX, Wang M, Kalina JO, Preckel B, Hollmann MW, Albrecht M, ZuurbierCJ, Weber NC. Empagliflozin prevents oxidative stress in humancoronary artery endothelial cells via the NHE/PKC/NOX axis. RedoxBiol. 2024 Feb;69:102979. doi: 10.1016/j.redox.2023.102979. Epub 2023Dec 2. PMID: 38061206; PMCID: PMC10749278.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38061206/
图片来源：所有图片均来源于参考文献
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