肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，在组织学上分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），NSCLC进一步细分为腺癌（ADC）、鳞状细胞癌（SCC）和其他不太常见的亚型，例如大细胞癌（LCC）。肿瘤相关成纤维细胞（TAFs），是最丰富的基质细胞类型，研究表明，非小细胞肺癌中的TAFs根据其来源肿瘤的组织学亚型表现出不同的表型改变，这表明TAFs促进肿瘤进展的机制可能与癌症亚型有关。
在TAFs中，获得的衰老表型正在成为主要的肿瘤促进过程。衰老细胞还可以表现出促炎因子和其他可溶性因子的分泌增加，称为衰老相关分泌表型（SASP）。值得注意的是，已经在几种实体瘤中发现了衰老的TAFs，其中侵袭性肿瘤进展与衰老TAFs的SASP有关。LCC肿瘤通常表现出侵袭性肿瘤表型，从LCC患者中分离出来的TAFs更有可能衰老，这表明LCC-TAFs的衰老可能与LCC肿瘤的侵袭性和增殖性特征增强有关。
西班牙巴塞罗那大学医学与健康科学学院、美国梅奥诊所癌症生物学系、意大利IRCCS国家肿瘤研究所等研究团队的一项工作发现，基质金属蛋白酶-1（MMP1）是成纤维细胞旁分泌衰老的关键LCC分泌因子，并随后增强肿瘤促进特性。这些结果确立了MMP1在癌症中的全新作用，并在LCC进展中定义了致瘤性衰老成纤维细胞的MMP1依赖性旁分泌激活的新模式。此外，基于靶向衰老的成纤维细胞确定了一种针对这种知之甚少的癌症类型的新治疗策略。
MMP1在LCC细胞系中选择性过表达，是衰老成纤维细胞旁分泌诱导所必需的
为了确定LCC细胞分泌的诱导共培养成纤维细胞衰老的因子，实验评估了一组随机选择的培养LCC（H460、H661）和非LCC细胞系（ADC和SCC：H1437、H358、H1703、A549和H23）。通过qRT-PCR证实，H460和H661 LCC细胞中的MMP1过表达。
为了评估LCC细胞表达MMP1是否是诱导共培养的成纤维细胞衰老所必需的，使用两种不同的质粒通过shRNA敲低了三种LCC细胞系（H460、H1299和H661）中的MMP1表达，Scr是用作对照，并分析了三种标准衰老标志物：衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-βgal）的诱导、永久性生长停滞和细胞周期抑制剂CDKN2A（p16 INK4a）在与MMP1表达减少的LCC系共培养的成纤维细胞中的表达。最终发现表明，MMP1在LCC细胞中的表达是成纤维细胞衰老的旁分泌诱导的原因。
LCC细胞中的MMP1敲低消除了共培养的成纤维细胞的促肿瘤作用，并损害了体内肿瘤的生长
之前表明，来自与LCC细胞系共培养的成纤维细胞的条件培养基（CM）可增强LCC细胞的生长和侵袭。在这里，实验发现当使用来自与shMMP1 LCC细胞（H460、H1299）共培养的成纤维细胞的CM时，这种效果会大大减弱（图1 A-D），并且在与H661细胞的共培养中发现了类似的结果。
细胞因子IL6和IL8被认为是衰老细胞分泌组或SASP的关键元素，并且在与感染对照（Scr）慢病毒的H460和H1299细胞共培养的成纤维细胞中，IL6和IL8在mRNA水平和作为分泌蛋白显著上调（图1 E-H），与衰老表型一致。然而，这种上调随着H460细胞的MMP1的敲低而显著减弱（图1 E、G），但在H1299（图1 F、H）或H661细胞系中效果不很明显，表明通过与表达MMP1的LCC细胞共培养增强的衰老成纤维细胞的促肿瘤特性与除IL6和IL8之外的SASP因子相关。
接下来，在带有MMP1敲低的H460细胞的肿瘤异种移植物中，LCC细胞的MMP1 mRNA仍显著下调。与体外研究结果一致，与亲本细胞相比，发现在携带shMMP1细胞的肿瘤中肿瘤生长和肿瘤吸收显著减少。此外还观察到，与对照H460细胞相比，来自shMMP1 H460细胞的肿瘤表现出更少的衰老成纤维细胞。这些观察结果强烈支持，LCC细胞中的MMP1是促肿瘤的衰老成纤维细胞异常积累所必需的。
重组MMP1（rMMP1）在共培养中部分挽救成纤维细胞衰老及其增强的促肿瘤特性
实验接下来评估了MMP1是否足以诱导成纤维细胞衰老和/或增强衰老成纤维细胞分泌组的促肿瘤特性。对照成纤维细胞使用45 U/ml活性rMMP1暴露7天并没有显著增加SA-βgal+成纤维细胞的比例（图2 A）或SASP标志物IL6和IL8的mRNA表达（图2 B、C）。一致地，单独用rMMP1处理的成纤维细胞的CM并没有增加H460（图2 D、F）或H1299（图2 E、G）的生长和侵袭，甚至降低了H460的侵袭。然而，将45 U/ml rMMP1添加到与shMMP1 H460或H1299细胞共培养的对照成纤维细胞的培养基中（图2 H）显著增加了SA-βgal阳性（图2 I、J）。补充rMMP1也挽救了shMMP1 H460或H1299诱导共培养成纤维细胞CM的生长和侵袭促进作用的能力（图2 K-N）。这些结果表明，单独的rMMP1不足以诱导成纤维细胞衰老或增强其CM的促肿瘤特性，并支持了它需要辅因子。
结合rMMP1和TGF-β1足以诱导成纤维细胞衰老和促肿瘤作用
因为来自LCC患者的TAFs表现出激活/肌成纤维细胞样表型，而TGF-β1是一种已知的成纤维细胞激活剂，在NSCLC中经常上调，并且与衰老有关，实验检查了rMMP1与TGF-β1组合对对照肺成纤维细胞的影响。最终观察结果揭示了MMP1和TGF-β1之间的一种新的相互作用，它引发了成纤维细胞衰老，同时增强了它们在LCC细胞上的分泌组的促肿瘤特性。
为了进一步说明TGF-β1在LCC诱导的成纤维细胞衰老中的作用，首先在Sanger数据库中的一组扩展细胞系中检测了TGFB1 mRNA，发现与非LCC系相比，LCC中TGF-β1显著上调。接下来，使用CAGA报告基因在共培养实验中检查了分泌的TGF-β1的生物活性，发现与裸对照相比，与H460 LCC细胞共培养的成纤维细胞显著增加，同时伴随成纤维细胞活化标志物COL1A1和α-SMA的表达增加。这些结果强烈支持在LCC细胞中选择性地存在异常大的TGF-β1表达。
氧化应激和F2R（PAR-1）参与了rMMP1和TGF-β1在成纤维细胞中的促衰老和促肿瘤作用
为了开始揭示由rMMP1和TGF-β1共同刺激引起的成纤维细胞衰老的机制，实验使用了三种互补策略，其中检查了氧化应激的作用。首先通过SA-βgal+细胞（图3 A）和SASP因子IL6和IL8的表达（图3 B、C），证实NAC在与H460共培养时减弱了成纤维细胞衰老。此外，发现NAC显著减弱了由rMMP1和TGF-β1共同刺激引起的SA-βgal+成纤维细胞的增加（图3 D），相应的CM显著降低了H460细胞的生长（图3 E）和侵袭（图3 F），表明氧化应激在LCC诱导的成纤维细胞衰老和随后的促肿瘤分泌组激活中都有作用。
最后分析了蛋白酶激活受体PAR-1的作用，它是一种G蛋白偶联受体，先前参与了由F2R基因编码的基质细胞中MMP1下游的信号转导。有趣的是，通过与rMMP1和TGF-β1共刺激或与H460细胞共培养来诱导成纤维细胞衰老，始终下调F2R（PAR-1）mRNA（图3 G)和相应的蛋白质表达（图3 H），而这种下调在与shMMP1 H460细胞共培养时被消除（图3 I）。同样，通过siRNA迫使对照成纤维细胞中的F2R下调（图3 J），与siControl相比（图3 K），在与H460细胞共培养时，SA-βgal+成纤维细胞的表达增加类似（图3 K），甚至衰老标志物IL6和IL8的表达量也更高（图3 L、M），暗示更强的衰老表型。这些结果强烈支持在rMMP1和TGF-β1下游引起的F2R下调可能与它们对成纤维细胞衰老的诱导有关。图3 N总结了所有这些机制的见解。
图3成纤维细胞中由rMMP1和TGF-β1引起的促衰老和促肿瘤作用的机制研究。
总之，该研究结果支持LCC细胞通过MMP1和TGF-β1的异常分泌引发肿瘤支持生态位，从而诱导相邻成纤维细胞衰老。衰老TAFs的这种异常增加可能至少部分是LCC侵袭性的基础，因为衰老成纤维细胞增强了LCC细胞的生长和侵袭，超出了非衰老成纤维细胞引起的范围，因此，在未来对这种罕见疾病的研究中测试抗衰老药物的可能性令人兴奋。
参考文献：Gabasa M, Radisky ES, Ikemori R, Bertolini G, Arshakyan M, Hockla A, Duch P, Rondinone O, Llorente A, Maqueda M, Davalos A, Gavilán E, Perera A, Ramírez J, Gascón P, Reguart N, Roz L, Radisky DC, Alcaraz J. MMP1 drives tumor progression in large cell carcinoma of the lung through fibroblast senescence. Cancer Lett. 2021 Jun 1;507:1-12. doi: 10.1016/j.canlet.2021.01.028. Epub 2021 Mar 6. PMID: 33684534; PMCID: PMC8026696.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33684534/
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