做了一周的 qPCR,组会汇报秒变《现代艺术的鉴赏和理解》。导师发动实验室来评价我结果图。师兄找到了悬崖、师姐找到了瀑布……反正就是没人能找到可用的曲线。跟结果沾边的线条,我是一条也没有,成为实验室的最新笑柄,登上实验室第一显眼包的位置……赶着导师把我送到艺术学院之前,我必须拿下 qPCR,跑出梦中情图。

虽然引物和试剂都是大家验证过的,可偏偏会被我跑的奇奇怪怪,也无法找到问题所在。每次实验前都神神叨叨,结果却和别人判若两图,那么该如何才能拿到自己的梦中情图?

Takara qPCR 答疑

Q1:扩增曲线的荧光信号值低的原因是什么?

A1:扩增曲线存在问题时,首先应确认基线校正或 ROX 校正前的原始曲线,扩增曲线的荧光信号值低多数是由于背景荧光信号值过高造成的。使用嵌合荧光法进行检测时,背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高,染料嵌入到初始模板 DNA 中发出荧光造成的。使用荧光探针法进行检测时,背景荧光信号偏高大多是由于设计的探针质量差使淬灭基团的淬灭作用不充分、报告基团和淬灭基团的搭配不合理、探针的荧光标记效率低等原因造成的。

Q2:进行 Real Time PCR 实验时,需要做哪些确认工作?

A2:1.引物和探针的序列是否有错误?组合是否正确?

2.Total RNA 是否有分解的可能?

3. 各种试剂是否忘记加入?

4. PCR 条件和荧光检出步骤是否设定正确

Q3:出现扩增曲线朝右下方下落现象的原因是什么?

A3:1.由于基线校正不恰当。确认设置的基线校正范围的参数,按仪器说明书要求重新设定再进行解析。

2. 使用的模板量过多,扩增曲线过早起峰,使基线校正不能正常进行。当扩增曲线在 10 Cycles 以内起峰时,要将模板稀释 100~1,000 倍后使用。

Q4:如何选择制作标准曲线的标准品?

A4:为了保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性,作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。例如以基因组 DNA 为起始材料时就要选择基因组 DNA 作为标准品,进行 mRNA 表达解析时最好选择表达目的基因的 Total RNA(或以 Total RNA 为模板合成的 cDNA)作为标准品。即使扩增碱基序列相同,但整体模板不同,也有可能导致 PCR 扩增效率不同(比如基因组 DNA 和质粒 DNA 等)。

Q5:使用什么方法来验证 qPCR 扩增产物?

A5:使用验证过的引物时,之前的融解曲线分析(Tm 值)可作为参考依据。如果 Tm 值与过去的验证结果相同,可以认为 qPCR 扩增产物与过去验证结果相同。

但是,请切记,相同的 PCR 产物具有相同的 Tm 值,但仅凭相同的 Tm 值并不一定可以确认 PCR 产物是相同的。应通过另外的方法来确认。如果是首次使用该引物,应使用电泳方法确认 qPCR 产物是否是预期的大小。

得到梦中情图,另一关键在于找对「实验搭子」。从 2004 年起,Takara 中国就已经研发出了高性能的 qPCR 产品,并完成相关技术在国内的普及。一路走来, Takara qPCR 产品线以高效率、高稳定性成为了科研人的优质「实验搭子」,帮助科研人员发表了海量文献,并收获了无数好评。

作为 qPCR 的元老级公司,必须帮助大家拿下实验!同时 2023 年恰逢 Takara 中国 30 周年。Takara 中国特此推出全新的染料法 qPCR 和反转录新品,以及三重「实验助力福利」!

福利一、Takara 新品免费试用

点击下方图片、识别小程序码或发送邮件至「chenx@takarabiomed.com.cn」,即可参与试用(试用规格如下表)。

福利二、Takara 新品让利

同庆 Takara 中国 30 周年纪念,即日起至 11 月 30 日,新品上市特价让利,折扣低至 3.3 折

打开网易新闻 查看更多图片

福利三、Takara 新品反馈征集

长期以来大量用户对我们的信任让我们无限感激,诚惶诚恐,唯有用更好的服务,更真诚的态度,回馈您的热爱!为了征集更多的成功案例及宝贵意见,特别推出了好评反馈征集活动。

参与方式:发送邮件至「chenx@takarabiomed.com.cn」了解详情。

新品介绍:通用、快速又高效的 qPCR 新品

打开网易新闻 查看更多图片

产品优势

高速反应:突变型 Taq DNA 聚合酶,适用于延伸时间 10 秒的快速 PCR 反应程序

高荧光信号:荧光信号值更高,扩增曲线 & 融解曲线线型更好,信噪比更高

高特异性:Buffer 添加了引物二聚体抑制因子,更大限度抑制引物二聚体的形成

高稳定性:实验验证的多个基因,反应液配制后室温放置 48 小时仍具有高稳定性,较长操作时间也可获得稳定结果

各仪器平台通用:预混通用参比染料,无需额外添加校正孔间荧光信号的参比染料

防止 carryover 污染:预混 UNG,避免扩增过程中的交叉污染导致的假阳性。PCR 程序中使用或不使用可自由选择

防止加样错误:预混可视化色素,减少操作错误

提高退火效率:预混 Tli RNaseH(耐热性 RNaseH),很好地抑制由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用,提高退火效率

新增组分,准确稀释:产品新增了组分 EASY Dilution Ⅱ(for Real Time PCR),用于标准品的稀释,可以获得更准确的定量结果。

注意:CN830 不能与 EASY Dilution(for Real Time PCR)(Code No. 9160)共同使用

实力源于专业

速度更快

(Takara Bio lnc. 比较结果)

(纵坐标:延伸时间为 30 s 得到的 Ct 值,横坐标:延伸时间为 10 s 得到的 Ct 值)

使用 Takara 新品 CN830 和 A 公司、B 公司同类试剂,延伸时间分别设置为 10 s 和 30 s,检测 32 个靶基因对应的Ct值。比较延伸时间为 10 s 和 30 s 获得的 Ct 值差异。

结果显示,CN830 在延伸时间设置为 10 s 和 30 s 得到的 Ct 值高度相关,说明 CN830 使用快速反应程序能够获得良好的结果,反应速度方面优于其他公司产品。

结果更好

(Takara Bio lnc. 比较结果)

(蓝色曲线:Takara CN830;绿色曲线:A 公司试剂;红色曲线:B 公司试剂)

在相同的反应条件下,使用 Takara 新品 CN830 和 A 公司、B 公司同类试剂,进行了扩增曲线和融解曲线分析的比较。

与其他公司相比,使用 CN830 得到的扩增曲线和融解曲线,都显示出更高的荧光信号,扩增曲线线型更好,信噪比更高。

特异性高

打开网易新闻 查看更多图片

(Takara Bio lnc. 比较结果)

Takara 新品 CN830 和 A 公司、B 公司同类试剂,对 32 个基因进行没有模板的 NTC检测。比较 NTC 实验中,引物二聚体出现的情况。结果显示,CN830 形成引物二聚体的概率更低,特异性更好。

稳定性高

(纵坐标:室温放置 48 小时后的 Ct 值;横坐标:不进行室温放置的 Ct 值)

使用 32 种靶基因引物和 CN830 制备 Master Mix 后,在 25 ℃ 下放置 48 小时。比较直接上机反应和放置 48 小时后再上机得到的 Ct 值。

结果显示,即使将 Master Mix 放置 48 小时后再检测,得到的 Ct 值也没有变化。较长操作时间也可获得稳定结果。

*仅作为性能展示,请按照说明书标准操作进行实验:冰上配置反应液,尽快上机反应。

多种仪器兼容

在以下仪器中确认了反应性能,CN830 具有广泛的仪器适用性。

一款专为 qPCR 服务的快速反转录新品 RR092「PrimeScript™FASTRT reagent Kit with gDNA Eraser」强势而来!

● 性能出色,gDNA 去除能力和反转录效率与 RR047 相当。

● 反应迅速,gDNA 去除反应只需 2 分钟,反转录反应从 15 分钟缩短至 10 分钟。

● 操作简单,gDNA 去除和反转录为 2 个预混试剂,只需按顺序加入预混试剂即可。

● 附带 EASY Dilution II(用于实时 PCR),可对核酸溶液进行准确的梯度稀释。

核心强大,性能依旧

试剂:Takara 经典高性能反转录产品 RR036、RR047 和新品 RR092

模板:小鼠肝脏 Total RNA(20 pg~2 ug)

扩增基因:Rps18 基因

结果显示:RR092 的 cDNA 合成能力与 Takara 现有的高性能反转录产品 RR047 和 RR036 相当

打开网易新闻 查看更多图片

同类比较,性能更优

试剂:新品 RR092 和 A 公司同类产品

模板:小鼠肝脏 Total RNA(20 pg~2 ug)+ 200 ng 小鼠基因组 DNA

结果显示:与同类试剂相比,RR092 的基因组去除性能更高,动态范围更广。

(Takara Bio lnc. 比较结果)

关于 Takara

Takara Bio 中国有两家公司--宝生物工程(大连)有限公司和宝日医生物技术(北京)有限公司。宝生物工程(大连)有限公司是 Takara Bio Inc. 在中国的生产基地,宝日医生物技术(北京)有限公司负责 Takara Bio Inc. 旗下所有品牌在中国市场的宣传及销售。

宝日医生物技术(北京)有限公司成立于 2004 年 1 月,公司主要销售生物工程研究用试剂和仪器(包括 Takara、Clontech、Cellartis 品牌),产品主要包括 PCR/qPCR、基因克隆、基因功能研究、蛋白质功能研究、二代测序、干细胞研究等产品及服务,并可提供客户定制化服务。还开展以细胞治疗为中心的生物工程领域的技术开发与服务,销售细胞治疗和基因治疗相关产品。

内容策划:邹礼平
内容审核:朱超敏

题图来源:图虫创意