在过去20年里，随着冠状病毒跨越物种屏障进入人类并导致严重疾病的增加，人们投入了大量精力来了解全球不同动物中的冠状病毒。
早在20年前，人们就已经发现了蝙蝠的sarbecoviruses，但研究人员从未从野外样本中分离出不依赖于ace2的sarbecoviruses，因此人们认为这些病毒对人类的风险很小。
近日，Journal of Virology在线发表了一篇题为“Isolation of ACE2-dependent and -independent sarbecoviruses from Chinese horseshoe bats”的文章，该研究结果显示，sarbecoviruses构成了更广泛的人畜共患病威胁，并阐明了冠状病毒分离和体外繁殖的复杂性。
2005 年，首个严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV) 的病毒亲属在犀牛蝙蝠中被发现，表明这些动物是 β 冠状病毒 sarbecoviruses 亚属的天然宿主。但与SARS-CoV相比，这些病毒在其刺突糖蛋白中含有大量的多态性，刺突糖蛋白是一种负责结合细胞受体分子并介导病毒侵入宿主细胞的病毒蛋白。
在之前的一项广泛筛选中，作者发现了几种RBD缺失的细胞表型，分为clade I, II, III, IV。并且进一步发现clade II可能具有感染人类细胞的能力。
病毒的分离和方法的优化
在这项研究中，为了评估胰蛋白酶介导的进入是否足以支持从野外样本中分离出clade II病毒,作者首先在胰蛋白酶存在下从中华马蹄蝠中分离三种新型病毒。
作者选择了来自武汉病毒研究所 (WIV) 生物库的 18 个蝙蝠粪便拭子或粪便样本，这些样本是在 7 年的时间里从单个蝙蝠身上收集的。对这18个样本进行了Rdrp的既定逆转录巢式PCR，发现16个呈现阳性。通过高浓度胰蛋白酶(100µg/mL)、冷培养基预洗步骤和接种期间的冷冻离心步骤，作者从人肝细胞系(Huh-7)的阳性样本中分离出三种sarbecoviruses，并将其命名为:RsYN2012、RsYN2016A和RsHuB2019A.
三种蝙蝠sarbecoviruses的细胞趋向性
接下来，作者测试并发现在有胰蛋白酶的情况下，RsYN2012和RsYN2016A以及RsHuB2019A在Caco-2,Calu-3以及VeroE6细胞中可以有效复制。胰蛋白酶存在下，HeLa细胞对RsHuB2019A是半允许的。
ACE2是clade I的受体，但不是clade II的
为了探索三种新型蝙蝠病毒的受体用途，作者使用表达人类和蝙蝠已知冠状病毒受体的 BHK-21 细胞进行了病毒感染性研究。结果显示，只有clade I(RsYN2012和RsYN2016A)可以利用人的ACE2进入细胞，而clade II(RsHuB2019A)无论在有或者没有胰蛋白酶的情况下，都不能使用任何已知的冠状病毒受体进入细胞。
组织培养的适应性降低了胰蛋白酶对ACE2不依赖的S蛋白降解
之后，作者通过三次病毒传代，并且在传代后通过NGS尝试在整个病毒基因组中寻找潜在的细胞培养适应性。发现clade II存在一个随传代次数逐渐增加的碱基突变，即V976L。进一步通过细胞-细胞融合实验，发现V967L突变的RsHuB2019A尖峰的病毒融合减少。进一步探索其进入刺突细胞的机制，发现V967L可能会降低该突变附近的胰蛋白酶消化，进而进入刺突细胞。综上所述，这些发现强烈表明，clade II病毒刺突适应了病毒繁殖过程中包括的外源胰蛋白酶，而不是细胞系本身。
纯化病毒粒子的电子显微镜显示了RBD分支之间的差异
最后，作者通过30%的蔗糖缓冲液纯化了病毒库，并通过透射电镜分析，进一步验证了三种冠状病毒并发现clade I病毒粒子上的糖蛋白层比clade I的密度要大的多。
总而言之，该项研究证明了sarbecoviruses构成了更广泛的人畜共患病威胁，并且描述了蝙蝠sarbecoviruses在人类细胞中的病毒进入机制，以及开发了一种病毒分离方法，允许对这些尚未研究的病毒进行探索。