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外泌体(exosomes),一种直径约30-150nm的纳米级囊泡,起源于细胞内吞过程中形成的内涵体,再从细胞中释放到胞外。几乎所有细胞都可以分泌外泌体。

外泌体是研究最热门的一种细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs),生物发生相对明确。外泌体的形成包括起始、内吞、多泡体形成、分泌四个过程。然而,由于实际提取过程中,无法获得完全纯化的外泌体。国际细胞外囊泡协会(ISEV)建议:将直径小于200nm的细胞外囊泡统称为小细胞外囊泡(small extracellular vesicle,sEV)。因此,将提取制备的外泌体称为小细胞外囊泡更加规范,与之相对的是大细胞外囊泡,即凋亡小体。小细胞外囊泡这一概念也被越来越多的论文采用及被越来越多的杂志接纳。

国际细胞外囊泡协会 (ISEV) 将细胞外囊泡(EVs)定义为“从细胞中自然释放的颗粒,由脂质双层包裹,不能复制,即不包含功能性细胞核”(Thery , 2018)

2013年,外泌体因诺贝尔生理学与医学奖而被众人知晓,也因此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。外泌体在体液中广泛存在及易获得性等特点被誉为液体活检"新秀",成为疾病的精确诊断和治疗研究的热点。

在细胞外囊泡发现75周年纪念之际,来自牛津大学等多位领域专家撰写关于细胞外囊泡简史,指出细胞外囊泡研究发展历程以及当前急需解决的问题。

细胞外囊泡研究历史

▉ 起源于凝血研究细胞外囊泡的研究源于凝血研究。细胞外囊泡的第一次发现,是在1946年。彼时,美国生物化学家埃尔文·查戈夫(Erwin Chargaff)和医生兰道夫·韦斯特(Randolph West)在寻找凝血因子的研究中,发现经高速离心后的血液沉淀具有显著凝血功能。除了包含凝血因子,他们认为还存在血细胞小碎片,也就是细胞外囊泡。

▉ 第一张外囊泡照片1967年,英国伯明翰大学彼得·沃夫(Peter Wolf)通过电镜获得第一张血小板来源细胞外囊泡照片(见下图)。

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▉ 典型的外囊泡生成途径

1974年,美国康奈尔大学医学院迈克尔 ·格申(Michael D. Gershon)教授在研究蝙蝠甲状腺的一项工作中,首次提出多囊泡体的概念,并认为细胞外囊泡是由多囊泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外的。这也是目前认为典型的外囊泡生成途径。下图展示多囊泡体(MB)与细胞外囊泡(EVs)电镜图。

▉ 外泌体和微囊泡的典型生成途径

在1950至1970年间,科学家在寻找病毒引发癌症的证据。好巧不巧,他们发现人体液来源“病毒样”囊泡,虽然后来证明这些囊泡与病毒无关。随后,人们发现外囊泡并非人体独有,在藻类、酵母和大肠杆菌中相继发现外囊泡的存在。下图展示外泌体(exosomes)和微囊泡(microvesicles)的典型生成途径。

细胞外囊泡发生的主要途径:当多泡体(早期核内体成熟并向内发芽形成腔内囊泡时形成)与质膜融合时,外泌体便从细胞中释放出来。外泌体(通常也称为微泡和微粒)是在质膜向外发芽和收缩时形成的。货物可以装入腔内囊泡(作为外泌体释放)释放。其他类型的囊泡,如凋亡小体,可由死亡细胞释放。

▉ 外泌体功能的发现

在19世纪80年代早期,是细胞外囊泡研究的爆发时期。美国华盛顿大学医学院克里夫·哈定(Cliff Harding)通过研究网织红细胞成熟过程,发现外囊泡是由多囊泡体与细胞膜融合后释放。加拿大麦吉尔大学罗斯·约翰斯顿(Rose M. Johnstone)将通过这种生成途径产生的外囊泡定义为外泌体(exosome),并且认为外泌体只是一种“垃圾桶”,在网织红细胞成熟过程,将不需要的转铁蛋白受体运输到胞外。

然而,科学家们很快就发现外泌体功能不局限于此,外泌体还具有酶活性,可以阻断细胞裂解,促进血液凝结和抗原递呈等活性。细菌来源外泌体和人肠道细胞存在着相互作用。其中,最具有里程碑意义的外泌体活性就是抗肿瘤,DC来源外泌体装载癌细胞抗原,可以用来根除肿瘤,并且进行了临床实验,由此吸引了广泛的注意并且引发外泌体研究的热潮。2018年,国际细胞外囊泡研究协会(ISEV)提出对外囊泡命名规范化建议,根据囊泡生成途径进行命名,但是外泌体(exosome)至今仍然也是一种RNA后期加工处理蛋白的专有名词。

细胞外囊泡研究的里程碑事件

下图是关于细胞外囊泡研究的里程碑时间表:

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1946年,Chargaff和West,发现一种促进凝血的细胞外囊泡。

1967年,Wolf,获得第一张细胞外囊泡电镜照片。

1974年,Nunez,拍摄到细胞外囊泡通过多囊泡体与细胞膜融合并释放的电镜照片。

1983年,Stahl和Johnstone实验室,提出外泌体是从经由多囊泡体与细胞膜融合并释放至胞外的外囊泡。

1996年,Raposo,证明细胞外囊泡具有生物学活性。

2006年-2008年,Ratajczak、Valadi和Skog等人,外泌体可以递送具有生物学功能的RNA。

目前,细胞外囊泡研究最大的挑战就是实验重复性问题,因为不同实验室的外泌体纯化方法不同,导致关于外泌体活性实验结果没有可比性,尤其是外泌体领域竞争激烈导致问题更加严重。

细胞外囊泡产业化的挑战之一是无法同时做到高产量、高纯度和短时间,其次就是外泌体表征方法需要提升,尤其是单外泌体表征方法,最后就是体内表征外泌体方法的创建。

细胞外囊泡产业化的挑战之一是缺乏某种单一组分的标志物,例如外泌体纯化过程往往混杂其他囊泡组分,使可靠的标志物研究变得困难,问题之二是细胞外囊泡被吞噬机理的研究,例如外泌体被摄取之后一般直接进入溶酶体被降解,而通过对外泌体载药递送方式的研究,可以更好改造外泌体作为药物递送平台。

文末小结

随着技术的进步,外泌体已经越来越被人们熟知,其应用也愈加广泛。外泌体是具有纳米尺寸的细胞囊泡,具有高生物活性,能参与细胞之间的交流,调控炎症水平、促进组织再生。

1. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. International journal of molecular sciences,18(3),538.
2. Exosomes in cancer development,metastasis,and immunity. Biochimica et biophysica acta. Reviews on cancer,1871(2),455–468. 3.The potential of exosomes as theragnostics in various clinical situations.Exosomes,467–486. 4. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.Cells,8(4),307. 5. 吴金恩, & 丁军涛. (2016). 外泌体生物学功能及应用研究进展. 动物医学进展, 037(012), 90-94.6. 吴奇, 杨国栋, 韦梦影, 马雪, & 陈辉. (2016). 外泌体的生物学功能及其在基因治疗中的应用. 现代生物医学进展(34), 6785-6788.

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