撰文丨十一月
黑色素是存在于各种生命形式中异质性存在的多聚体，在色素沉着、环境适应以及物种适应性等方面发挥着重要功能。在人类中，黑色素的合成是在黑色素细胞中的黑素小体（melanosome）中进行的。黑素小体中黑色素合成的改变会导致皮肤、头发以及眼睛颜色的变化，而黑色素合成的异常则与疾病相关。但目前为止，并没有系统地关于色素沉着相关遗传因子的分析。为此，美国斯坦福大学医学院Joanna Wysocka研究组在Science发文题为A genome-wide genetic screen uncovers determinants of human pigmentation，通过黑色素光学特征进行了黑色素生成调节因子的全基因筛选，发现了超过百个黑色素促进蛋白基因，对于人体色素基因的变异、医疗药物靶点开发提供了大规模的数据资源。
黑色素具有比如高折射率等特殊的理化性质，由此也决定了其光学性质。作者们考虑如果黑色素在黑素小体中的累积会改变黑色素细胞的光散射特性。因此，通过流式细胞术可以做为活黑色素细胞中黑色素含量的替代指标。黑色素细胞位于表皮，在黑素小体的亚细胞溶酶体相关的细胞器中合成黑色素【1】。黑素小体成熟过程中经历腔内囊泡的I期、黑色素沉积的II期以及部分黑色素沉积的III期以及完全黑色素沉积的IV期【1】。
为了对黑素小体中控制黑色素合成的基因进行鉴定，首先作者们希望建立黑色素含量与光散射的关系。为此，作者们使用了两种不同的黑色素生物合成的细胞模型。首先，作者们使用SOX10:: GFP标记的神经嵴细胞诱导分化，形成无色素的黑色素细胞前体细胞，被称为黑色素母细胞（Melanoblast），随后持续形成成熟的黑色素细胞（Melanocytes）。作者们发现随着黑色素含量的增加，光散射也会增加，并且两者之间呈现很强的线性相关（图1）。之后，作者们在MNT-1黑色素瘤细胞系模型，通过删除黑色素生成基因的酪氨酸酶TYR会导致黑色素沉着的丧失和减少，黑色素吸光度的测量也显著降低。由此，作者们建立了流式细胞术做为黑色素含量的代替指标。
图1 光散射做为黑色素含量的指标
随后，作者们希望进行全基因组CRISPR筛选鉴定黑色素含量促进基因，因此作者们构建了一个表达SpCas9的诱导品系，并通过转染表达全基因组慢病毒sgRNA文库。之后作者们通过高通量测序以及Cas9高通量最大似然估计对每个基因的效果进行分析【2】（图2）。该筛选共筛选到了169个推定的黑色素促进基因，其中有34个基因已知与黑色素合成的相关。
图2 全基因组筛选黑色素促进基因
之后，通过对英国生物银行UKBB数据库的分析以及30个人体皮肤样本RNA测序，作者们发现基于CRISPR筛选到的备选因子中有67.7%的基因会在肤色更深的个体黑色素细胞中具有更高的表达。
为了对备选基因在黑色素合成中的调控机制进行解析，作者们将目光集中在了转录因子KLF6以及内体循环蛋白COMMD3。在小鼠中通过条件性删除一个拷贝或者两个拷贝的Klf6基因，作者们发现KLF6参与调节黑素小体最后的成熟阶段。另外，通过细胞中实验作者们证明COMMD3参与到黑素小体中pH的调节之中。
图3 工作模型
总的来说，作者们的工作建立了黑色素含量与光散射的量化关系，从而能够以此作为大规模遗传筛选的平台，确定了135个新颖的黑色素促进基因。进一步通过在小鼠体内对靶标基因比如转录因子KLF6以及内体循环蛋白COMMD3在调节黑色素细胞成熟以及黑素小体pH中的功能，为皮肤色素沉着提出了新的调节机制。
原文链接：
https://doi.org/10.1126/science.ade6289
制版人：十一
参考文献
1. G. Raposo, M. S. Marks, Melanosomes—Dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 786–797 (2007). doi: 10.1038/nrm2258; pmid: 17878918
2. D. W. Morgens, R. M. Deans, A. Li, M. C. Bassik, Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nat. Biotechnol. 34, 634–636 (2016). doi: 10.1038/nbt.3567; pmid: 27159373