撰文丨亦
在哺乳动物中，存在着这样一群特殊的基因，其编码Fos，EGR和NR4A家族的转录因子，负责对生长因子、神经因子及免疫刺激的转录响应，它们被称为即刻早期基因（immediate-early genes,IEGs）【1】。IEG蛋白在几乎所有哺乳动物细胞中都被固有激活，但其会促进细胞类型特异的晚期响应基因（late-response gene,LRG）的转录，最终对接受的刺激形成响应【2】。在接受刺激的几分钟内，IEG mRNAs会大量积累，一旦转录，其蛋白会迅速被降解【3】。与IEG的转录得到广泛研究不同，IEG蛋白如何被迅速靶向降解多年来一直是一个谜。而有研究表明，IEGs表达的失调会导致癌症、免疫缺陷和神经系统疾病。因此，研究IEG蛋白调控机制具有十分重要的意义。
真核生物依赖于蛋白酶体来对泛素化蛋白进行降解，但Fos家族被发现能通过泛素化不依赖的机制为蛋白酶体所靶向【4-5】。基于此，作者猜想细胞内存在途径负责c-Fos和其他IEG蛋白的快速降解。2023年8月25日，来自哈佛大学医学院神经生物学系的Michael E. Greenberg与哈佛大学医学院遗传学系的Stephen J. Elledge合作，共同在Science上发表了题为The midnolin-proteasome pathway catches proteins for ubiquitination-independent degradation的文章，作者通过全基因组范围内的CRISPR-Cas9筛选，找到了调控IEG蛋白稳定性的基因，发现哺乳动物体内一个全新蛋白——midnolin，其促进IEG蛋白的破坏与降解。
作者首先使用全局蛋白稳定（global protein stability,GPS）报告系统，在人胚胎肾细胞 (HEK) –293T细胞系中测试了IEG蛋白的稳定性，并基于CRISPR-Cas9筛选找到了与IEG蛋白降解有关的候选基因MIDN，并通过敲除和过表达实验验证了MIDN编码的蛋白在IEG蛋白降解中的作用。随后，作者构建了NIH/3T3成纤维细胞的MIDN突变体，发现IEGs在细胞周期调控中起重要作用，MIDN的敲除和过表达分别阻碍和促进了IEG蛋白的降解。在胚胎小鼠皮层神经元中，IEGs调节神经元的响应，且MIDN表达也影响IEG蛋白降解。至此，作者初步证明midnolin受多种刺激诱导，大概率通过反馈机制促进IEG蛋白降解。
接下来，作者想知道midnolin是否也以类似的机制调节其他胞内蛋白。利用GPSORFeome文库进行筛选，此文库包含约12,000种人类开放阅读框的GPS报告系统，作者发现了midnolin的其他靶点，包括FosB，c-Fos，CBX4等，大多数都是谱系特异的转录因子。同样，在过表达和敲除实验验证后，作者证实了midnolin在多种组织和细胞类型基因表达上的重要调控作用。
那么midnolin的作用机理是什么呢？作者构建了一个内源midnolin带3xHA标记的HEK-293T细胞系，通过免疫沉淀质谱，作者发现midnolin似乎是直接与蛋白酶体相互作用。随后，作者开始探究其作用是否是通过泛素化蛋白酶体依赖的方式进行，GPS报告子在MIDN敲除的HEK-293T细胞中稳定表达，作者发现midnolin并不需要泛素化来与蛋白酶体产生关联，当其底物的泛素化位点突变后，midnolin还是会带来高效降解。于是作者利用lphaFold对midnolin的结构进行了预测，发现其包含3个结构域，其一是泛素样结构域（ubiquitin-like domain,Ubl），其二是“Catch”domain，其三是C端的α helix。作者在MIDN敲除的HEK-293T细胞中分别表达野生型和突变型的midnolin后，发现Ubl, Catch, αHelix-C的点突变都会使midnolin丧失功能。共免疫沉淀实验结果显示，midnolin泛素化不依赖的降解取决于Ubl结构域，αHelix-C负责其与蛋白酶体的互作，而Catch domain则对于midnolin与底物的结合至关重要，具体而言，Catch domain会与底物形成β链degron，从而兼容。Midnolin的3个结构域协同作用，最终实现不依赖于泛素化的蛋白酶体降解。
总的来说，文章发现了一套蛋白酶体绕过经典的泛素化系统实现对核蛋白选择性降解的新的普适化机制，即midnolin-蛋白酶体途径。它促进许多核蛋白的破坏与降解，包括由IEGs编码的转录因子。Midnolin的Catch domain识别底物中相对退化的可能形成β链的双亲性区域，通过α螺旋与蛋白酶体进行关联，最终在ubiquitin-like domain的作用下促进底物破坏与降解，但这一通路如何被不同细胞类型的不同因素调控还有待进一步探索。
https://doi.org/10.1126/science.adh5021
制版人：十一
参考文献
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2. E. L. Yap, M. E. Greenberg, Activity-regulated transcription: Bridging the gap between neural activity and behavior.Neuron100, 330–348 (2018). doi: 10.1016/j.neuron.2018.10.013; pmid: 30359600
3. S. Bahrami, F. Drabløs, Gene regulation in the immediate-early response process.Adv. Biol. Regul.62, 37–49 (2016). doi: 10.1016/j.jbior.2016.05.001; pmid: 27220739
4. G. Bossis, P. Ferrara, C. Acquaviva, I. Jariel-Encontre, M. Piechaczyk, c-Fos proto-oncoprotein is degraded by the proteasome independently of its own ubiquitinylation in vivo.Mol. Cell. Biol.23, 7425–7436 (2003). doi: 10.1128/MCB.23.20.7425-7436.2003; pmid: 14517309
5. T. Gomard et al., Fos family protein degradation by the proteasome.Biochem. Soc. Trans.36, 858–863 (2008). doi: 10.1042/BST0360858; pmid: 18793151