*仅供医学专业人士阅读参考
周四了！让我们整点小小的《自然》震撼吧！
今日，CRISPR大牛张锋团队在《自然》杂志发表新成果，研究者们从微生物取材，制造出了全新的蛋白递送系统。该系统形似“注射器”，可以通过改变结合基团以接近100%的效率靶向特定细胞，递送Cas9蛋白等基因编辑组件或生物毒素，以实现基因编辑、调控特定生理过程乃至杀死癌细胞等目的。
从目前的实验细节来看，该系统不仅效率奇高、灵活多变，且免疫原性和生物毒性很低、代谢也非常快，实在是具有了一个好工具的多项优良品质。
感觉继CRISPR之后，生物学研究的工具箱又要大升级了！
就是这回咋没给取个酷炫的名字啊，啥的
论文题图
类似CRISPR，这次的新蛋白递送系统也取材于大自然，原型说起来还真有点震撼呢。
细胞和细胞之间想要传递信息，除了直接“贴贴”，就是分泌调节因子。但这些因子很多时候不能轻松穿透细胞膜，为了克服这个困难，很多“奇怪”玩意儿就出现了。其中之一就是来自细菌的细胞外可收缩注射系统（eCIS）。
这个东西长得和噬菌体有点像，动作颇像注射器，识别到靶细胞后刺突蛋白穿透细胞膜，随后上端的鞘状结构收缩将内容物“挤”进细胞内。
细想它就只是个蛋白啊，生物真是怪神奇的。
eCIS工作流程
噬菌体向宿主细胞内注射DNA丨图源wiki
eCIS广泛分布在细菌和古细菌中，已经被验证到的功能非常丰富，近期还有研究发现它能够靶向小鼠细胞。
脑子灵活的科学家已经想到了，这东西，可以利用！
那么我们先来搞搞清楚它的结构吧。张锋团队选择的目标是来自发光杆菌（Photorhabdus）属的一种线虫共生菌，将它的eCIS命名为Photorhabdus virulence cassette（PVC）。
PVC本体基因不足20kb，含16个关键基因，这些基因哪个编码哪部分结构可以看下图↓，下游基因编码内容物，在原装PVC中就是用于杀死线虫细胞的生物毒素Pdp1和Pnf。
PVC基因
显微镜下的PVC颗粒，长116nm
那么PVC是如何识别靶细胞的呢？参考噬菌体的结构，研究者猜测应当是尾纤维，也就是pvc13编码的部分承担了识路任务。
用AlhpaFold推测了一下Pvc13的结构，研究者发现在它的C端形成了一个螺旋管，尖端的球状结构域就是结合靶细胞的关键结构。改变这个部分，我们就能操纵PVC去任何我们想去的地方了。
Pvc13结构
为了测试这一点，研究者设计了两个不同的结合基团，一个改造自人类腺病毒5（Ad5）的纤维旋钮（Knob），一个是可以靶向特定受体的设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）。
内容物则是选择了CRISPR常用的SpCas9和另一种基因编辑技术元件锌指蛋白（ZFD），以及原装的生物毒素Pdp1/Pnf。
结果真是相当令人吃惊，在A549人类肺腺癌细胞（可被Ad5识别且过表达EGFR可被针对EGFR的DARPin识别）中，改装PVC的效率相当高，几乎不会误识别其他非靶细胞，无论基因编辑还是细胞杀伤都完成得相当不错。
值得注意的是，Cas9蛋白大小约170kDa，而原装的Pdp1/Pnf仅有37kDa，PVC还是很“能装”的。
Cas9/锌指蛋白/针对CD4+T的特异性杀伤
实际上，研究者们在HEK 293FT细胞中针对一组非天然表位进行了测试，结果就是PVC的特异性真的是相当不错。
针对不同表位，PVC特异性都很高
最后一步，PVC的体内效果如何？
研究者再次利用AlphaFold模拟Pvc13变体，筛选出了能够靶向小鼠细胞的新结构域，令其携带Cre报告系统，并注射到红色荧光报告基因小鼠脑内海马体。
实验结果显示，小鼠海马体中出现了红色荧光，证明PVC在体内也具有活性。而且分离小鼠脑细胞后，研究者发现，荧光信号富集于神经元中，说明实现了对神经元细胞的靶向。
在小鼠海马体中观察到荧光信号
此外，小鼠未表现出任何免疫细胞活化、未产生炎性细胞因子，小鼠体重未减轻。注射7天后，小鼠脑内无法检测到PVC。
安全、有效、代谢快！
如此简洁有力的工具让人思路迸发，实验中已经展示了PVC在基因编辑和对特定受体细胞（EGFR/CD4）杀伤上的使用，通过改变结构域和内容物的搭配，我们还能够实现对更多生物过程的精准调控。
而且这还只是一个PVC呢，其他细菌也有自己的eCIS，它们会不会还有其他我们没发现的有趣之处呢？真是太令人期待啦！
参考资料：
[1]Kreitz, J., Friedrich, M.J., Guru, A. et al. Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7
[2]Mix-and-match tools for protein injection into cells (nature.com)
本文作者丨代丝雨