摘要
背景：尚未对目前可用于犬猫十二指肠贾第虫感染的临床诊断试验进行评估。此外，在已发表的诊断比较中也有不一致之处。缺乏检测十二指肠贾第虫的真正金标准也使诊断评估复杂化。
目标：评估美国市场上用于检测犬猫十二指肠贾第鞭毛虫的诊断试验，并与广泛使用的参考试验直接免疫荧光试验(IFA)进行比较，同时比较两种分析方法的结果:诊断试验与参考试验的比较(IFA)和贝叶斯分析。
动物：来自科罗拉多州、俄克拉荷马州和弗吉尼亚州388只猫和犬的粪便样本。
方法：采用硫酸锌离心粪便漂浮法和4种不同的商业诊断免疫测定法对粪便样品进行十二指肠贾第鞭毛虫的检测。结果通过贝叶斯分析和对比IFA作为参考试验进行分析。
结果：与IFA相比，所有犬猫诊断试验的敏感性和特异性分别为≥82%和≥90%。当通过贝叶斯分析时，敏感性和特异性分别为≥83%和≥95%。当ZnSO4离心粪便漂浮结果与免疫测定结果相结合时，商业临床免疫测定的灵敏度之间不再有显著差异。
结论和临床相关性：贝叶斯分析使用IFA作为参考测试进行验证。当结果与ZnSO4离心粪便漂浮结果相结合时，商业临床免疫测定灵敏度的差异可以得到缓解。
关键字：犬科，直接免疫荧光，粪便漂浮，猫科，免疫测定，原生动物
缩写：CAPC, Companion Animal Parasite Council; IFA, MERIFLUOR Cryptosporidium/Giardia direct immunofluorescent assay; SNAP, IDEXX Giardia Antigen Test (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME); VetChek, TECHLAB VETCHEK ELISA (TechLab Inc., Blacksburg, VA); VetScan, Abaxis VetScan Giardia Antigen test (Abaxis, Inc., Union City, CA); ZnSO4, Zinc sulfate centrifugal fecal flotation.
引言
十二指肠贾第鞭毛虫是一种常见的犬猫肠道原虫。大多数感染是亚临床的，但也可能发生急性或慢性腹泻。十二指肠贾第鞭毛虫感染的患病率因受调查动物的年龄、临床状况、居住环境和地理区域而异，并受所用检测方法的影响。历史上，对犬和猫的十二指肠贾第鞭毛虫的诊断是通过粪便包囊中滋养体或包囊的显微镜检查。然而，十二指肠贾第鞭毛虫的显微镜诊断的准确性受限于腹泻粪便中滋养体的罕见存在、的间歇性通过以及需要有经验的技术人员进行检查。与常规漂浮试验相比，直接免疫荧光试验(IFA)对十二指肠贾第鞭毛虫的诊断更敏感、更特异，是评估伴侣动物十二指肠贾第鞭毛虫试验的参考试验。检测十二指肠贾第鞭毛虫的可溶性包囊抗原的免疫测定也是可用的。在美国被广泛引用为寄生虫控制指南来源的动物寄生虫委员会(CAPC)建议，在兽医实践中，将离心粪便漂浮法与诊断十二指肠贾第鞭毛虫感染的免疫测定法结合使用(www.capcvet.org)。这得到了证据的支持，即当与商业免疫测定一起使用时，粪便漂浮的灵敏度得到了提高。
诊断测试评估通过与金标准参考测试进行比较。然而，通常没有真正的金标准用于测试比较，十二指肠贾第鞭毛虫就是这种情况。IFA被广泛认为是十二指肠贾第鞭毛虫最敏感和特异的检测方法，并经常被用作参考检测方法。但是，它不是真正的金标准(即，”...绝对准确”)，使用不完善的参考测试作为诊断比较的金标准可能会导致被评估测试的测试性能的错误计算。为了克服这个问题，可以进行贝叶斯分析。这种统计方法允许在没有金标准的情况下进行诊断试验评估，并已用于十二指肠贾第鞭毛虫诊断试验评估。
已经对各种十二指肠贾第鞭毛虫诊断试验进行了评估，以检测小动物的感染，但并非所有的比较都包括参考试验。本研究的目的是通过与参考试验(IFA)进行比较，评估在美国市场上可买到的诊断试验，这些试验经过优化，可用于检测犬和猫的十二指肠贾第鞭毛虫，并使用贝叶斯分析比较所有诊断试验，包括IFA。
材料和方法
从2012年到2014年，在3个不同的研究地点从犬和猫收集粪便样本(n = 388)。这些地点是科罗拉多州柯林斯堡兽医教学医院的寄生虫学实验室；俄克拉荷马州斯蒂尔沃特；和弗吉尼亚州的布莱克斯堡。所有3个地点的样本包括医院提交的资料(健康检查和临床病例)，加上来自动物收容所和救援组织的收集调查。
在每个研究点，使用硫酸锌离心粪便漂浮法(ZnSO4)筛查样本中是否存在十二指肠贾第鞭毛虫包囊，如下所述。研究中包括足够数量的十二指肠贾第鞭毛虫阳性样本，以执行所有诊断测试。记录每个样品的粪便稠度和其他寄生虫的存在。对于每个十二指肠贾第鞭毛虫阳性样品，研究中包括来自相同地理位置的相同粪便稠度的匹配十二指肠贾第鞭毛虫阴性样品(通过ZnSO4漂浮)。该选择程序用于确保有足够数量的十二指肠贾第鞭毛虫阳性样本用于有意义的分析，因为其在一般犬猫群体中的流行率相对较低。在研究接近尾声时，所有来自弗吉尼亚州收容所收集的粪便样本，无论是阳性还是阴性，都被纳入样本池，以增加整体样本量。从俄克拉荷马州和科罗拉多州收集的样本被冷藏，每周用冰袋运送到主要研究地点。在每个研究地点进行样本选择和粪便漂浮，并且在样本到达后，每周在主要研究地点(弗吉尼亚州布莱克斯堡)进行所有免疫测定。主要研究地点未重复进行硫酸锌粪便漂浮。
粪便漂浮
如Zajac和Conboy所述，使用2-4g粪便进行硫酸锌离心粪便漂浮。将粪便和硫酸锌溶液（比重1.18）用盖玻片以200×g离心5分钟。离心后，将盖玻片移到载玻片上，用显微镜以100×扫描十二指肠贾第虫包囊，如果未检测到包囊，则以200×。十二指肠贾第虫和任何其他存在的寄生虫物种均记录为存在，但未进行定量。
免疫分析
VETCHEK ELISA (TECHLAB Inc，Blacksburg，Virginia) (VetChek)是一种酶免疫测定法，用于定性检测犬猫粪便标本中的十二指肠贾第鞭毛虫包囊抗原。测试是按照制造商的说明进行的。这是第一个商业化的多孔板ELISA，并针对犬和猫的使用进行了优化。
SNAP贾第鞭毛虫抗原检测(IDEXX Laboratories，Westbrook，Maine) (SNAP)是一种快速的临床酶免疫测定法，用于检测犬猫粪便中的十二指肠贾第鞭毛虫抗原。按照制造商的说明进行测试。
Abaxis VetScan贾第鞭毛虫抗原检测(VetScan)是一种快速的临床酶免疫测定法，仅用于检测犬粪便中的十二指肠贾第鞭毛虫抗原。按照制造商的说明进行测试。虽然这项测试不用于猫，但它被包括在猫的比较中，因为如果该测试在他们的诊所可用，从业者可能会考虑对猫使用VetScan。VetScan cat结果被排除在统计分析之外，因为制造商不打算将该测试用于猫。
MERIFLUOR隐孢子虫/贾第鞭毛虫直接免疫荧光检测法(Meridian Bioscience Inc，Cincinnati，Ohio) (IFA)被用作参照试验，并按照制造商的说明进行，以鉴定粪便中的十二指肠贾第鞭毛虫。样本分批运行，每次运行测试时都有阳性和阴性质控品。在100倍下检查载玻片，如果没有检测到包囊，则使用荧光显微镜在200倍放大下检查。如果检测到任何十二指肠贾第鞭毛虫，则认为样品呈阳性。如果观察到隐孢子虫卵囊，也记录了其存在，但结果未在此报道。
统计分析
通过多种方法分析数据。通过与IFA比较，计算粪便漂浮和免疫测定的灵敏度和特异性。然后使用McNemar检验比较每种诊断试验的敏感性和特异性的差异，以确定变化的显著性。这些分析分别对来自犬和猫的数据进行。此外，临床免疫分析结果(SNAP和VetScan)与犬只体内的ZnSO4粪便漂浮结果(即，如果至少有一项检测呈阳性，则样本被视为呈阳性)结合在一起进行分析，以模拟CAPC建议的临床应用。然后使用McNemar检验对变化的显著性，比较组合结果在敏感性和特异性方面的差异。最后，进行了贝叶斯分析，其中没有测试被认为是参考标准，以分别估计犬和猫的每种诊断测试的敏感性和特异性。
贝叶斯分析框架将Lawrence Joseph及其同事（www.medicine.mcgill.ca/epidemiology/Joseph/Bayyesian-Software-Diagnostic-Testing.html）编写的3个测试脚本Bay-esDiagnosticTests\src\tt3.txt扩展为5个测试犬样本数据，4个测试猫样本数据。实际软件的理论基础（贝叶斯诊断测试版本3.10.2，2016年1月）已经报道。新脚本是使用WinBugs 1.4.3版实现和执行的。要估计的参数包括犬科或猫科动物的总体患病率，以及每个诊断测试的敏感性和特异性。脚本中的差异包括敏感性和特异性诊断测试之间的成对比较。模型的先前信息是从已发表的研究和制造商信息中获得的。将先验信息整理并总结为平均值（±SD），随后将其转换为β先验密度的α和β参数（表1）。更新先前信息的研究证据以犬科和猫科动物样本交叉分类的形式呈现（表2）。初始化后，所有模型运行25000次迭代（5000次用于老化，20000次用于参数估计）。检查跟踪图以验证收敛性，并验证每个参数的蒙特卡罗误差小于样本SD的5%。最后，对于每个感兴趣的参数，从后验分布中获得中位数以及2.5和97.5%。
结果
总共388份样品(127份猫科动物样品和261份犬科动物样品)包括在研究中，并通过每次诊断试验评估十二指肠贾第鞭毛虫的存在。表2列出了每次诊断测试的交叉分类结果。在测试的388个样品中，108个(24个猫和84个犬)在所有5个诊断测试中对十二指肠贾第鞭毛虫呈阳性，而210个(82个猫和128个犬)在所有诊断测试中呈阴性。总的来说，388份样本中有318份(82%)在所有5项诊断测试中结果一致。关于每个样本的地理来源，与不同研究地点的IFA相比，初始ZnSO4粪便漂浮的灵敏度或特异性没有差异。
与IFA相比
在表3和表4中列出了每种试验与犬和猫的IFA参照试验相比的灵敏度和特异性。对犬类数据的单独分析表明，与IFA相比，灵敏度最高的测试是VetChek (94.1%)，其次是SNAP (89.8%)。对犬进行的McNemar试验结果表明，ZnSO4漂浮法、VetChek法和SNAP法的灵敏度都明显高于VetScan法。当犬的临床免疫试验结果与ZnSO4粪便漂浮试验结果相结合时，如果免疫试验或漂浮试验呈阳性，则认为犬呈阳性，SNAP和VetScan免疫试验在犬中的灵敏度不再有显著差异。犬的临床免疫试验(SNAP和VetScan)之间的特异性没有统计学显著差异。VetScan (97.2%)和SNAP (95.1%)的特异性均显著高于VetChek和ZnSO4粪便漂浮(均为92.3%)。
在猫中，当与IFA(表4)比较时，所有3种测试具有相同的灵敏度(92.5%)，并且对于每种诊断测试，特异性≥95%。在猫中进行的任何测试的敏感性和特异性之间没有统计学上的显著差异。当猫的免疫测定(SNAP)结果与ZnSO4粪便漂浮结果相结合时，灵敏度确实从92.5%提高到97.5%，但这种差异没有统计学意义。
贝叶斯分析
表5显示了使用贝叶斯分析对犬进行的每个诊断测试的估计灵敏度、特异性和95%置信区间。最敏感的诊断试验是IFA (99.4%)，也是最特异的(99.7%)。虽然VetScan的灵敏度最低(83.3%)，但它的特异性最高(99.3%)，仅次于IFA。所有其他诊断试验的特异性≥95%。
使用贝叶斯分析对猫科动物数据的分析如表6所示。最敏感和特异的诊断试验是IFA(分别为99.9%和99.8%)。在猫中，ZnSO4漂浮和SNAP的灵敏度相似(分别为92.9%和91.1%)，其特异性也相似(分别为98.5%和98.8%)。VetChek的敏感性为94.4%，特异性为95.7%。与其在犬中的表现相似，SNAP (98.8%)在特异性上遵循IFA。
结果的重要性
本研究评估了犬和猫十二指肠贾第鞭毛虫检测的诊断试验，使用了与参考试验的比较和用于数据分析的贝叶斯方法。本研究中的贝叶斯分析与IFA的直接比较有很好的相关性，这为之前将结果与IFA进行比较的研究提供了支持。总的来说，当在猫和犬中将诊断测试与作为参考测试的IFA进行比较时，没有一项测试明显是最佳诊断，因为所有测试都具有相对较高的敏感性和特异性。尽管与犬的IFA相比，临床免疫测定(SNAP和VetScan)之间的灵敏度存在显著差异，但当抗原测试结果与ZnSO4漂浮结果结合时，这种差异不再显著，并且在贝叶斯分析中也不具有统计学意义。该数据强烈支持在兽医实践中使用离心粪便漂浮结合免疫测定诊断十二指肠贾第鞭毛虫感染的建议。与犬的其他诊断评估相比，我们的研究具有更高的ZnSO4漂浮灵敏度。但是，由于我们使用ZnSO4筛选样品，并包括阳性和匹配的阴性，因此与其他研究相比，本研究可能增加了ZnSO4的灵敏度。此外，本研究未显示阳性和阴性预测值，因为这些变量依赖于所检测疾病的患病率，并且在不同人群中差异很大。这项研究人为地提高了十二指肠贾第鞭毛虫的发病率，因为我们选择了阳性样本纳入研究，以便进行更有力的比较。
该研究还证实了当怀疑十二指肠贾第鞭毛虫感染时，进行1次以上测试的价值。有几个样本的结果不一致(表2)。特别是，有5个样本(4个犬科动物和1个猫科动物)在ZnSO4粪便漂浮试验中呈阳性，但在IFA和所有其他免疫测定中呈阴性，另外2个样本(均为犬科动物)在ZnSO4粪便漂浮试验和VetChek试验中呈阳性，但在IFA、SNAP和VetScan试验中呈阴性。还有4份样品(全部为犬科动物)在IFA检测中呈阴性，但在所有其他诊断检测中呈阳性。至少对其中一些样本来说，IFA结果很可能是假阴性。然而，在粪便漂浮和进行免疫测定之间的冷藏、储存和运输样品也可能导致阳性ZnSO4粪便漂浮和阴性免疫测定结果之间的一些差异，特别是在低包囊数的样品中。这些不一致的结果表明，在没有检测十二指肠贾第鞭毛虫的真正金标准的情况下，在比较诊断试验时，很难确定哪种诊断试验最准确。
与IFA相比
与IFA相比，VetChek是这项研究中最近获得许可的免疫测定法，是对犬最敏感的测试。与IFA相比，猫和犬的SNAP试验的灵敏度分别为92.5%和89.8%，低于包装说明书上的报道(95%)，但与其他报道相似。
贝叶斯分析
贝叶斯分析中IFA、ZnSO4和SNAP的敏感性和特异性比其他人报道的更高。SNAP测试的灵敏度为92.2%，远高于之前分析中报道的灵敏度(52%和67%)。与其他研究(34%和65%)相比，本研究(90.95%)中通过贝叶斯分析估计的ZnSO4敏感度也要高得多。这些差异的一个可能解释是，在以前的研究中使用了更多的非信息先验，这在建立模型时对所讨论的变量的影响最小。我们能够利用以前研究中的先验信息，这可能会导致本研究中更严格的分析。
其他研究也发现，当使用贝叶斯分析比较测试时，IFA是最敏感的测试。这强调了IFA的高性能，并提供了更多的证据来支持使用IFA作为事实上的参考测试，即使它不是一个真正的金标准，有可能出现假阴性/阳性。
结果的实际应用
评估诊断测试时，考虑测试目的很重要。SNAP和VetScan都是不需要额外设备的快速临床测试。尽管ZnSO4离心粪便漂浮试验的周转时间很短，但它确实需要离心机。尽管VetChek不是设计用于临床快速检测的，但通过与IFA和贝叶斯分析的直接比较，vet chek的表现与其他目前可用的诊断方法一样好，可被视为十二指肠贾第鞭毛虫检测的敏感和特异性检测。IFA需要最专业的设备和培训，但兽医行业不具备这些条件。
总之，现在有几种高度敏感和特异的抗原试验，它们被优化用于检测动物体内的十二指肠贾第鞭毛虫。然而，只有离心粪便漂浮法能够检测可能存在的其他寄生虫，免疫测定法和显微镜技术的结合为检测十二指肠贾第鞭毛虫和其他体内寄生虫感染提供了最灵敏的方法。
致谢
This study was supported by funds from TechLab, Inc, Blacksburg, VA. Portions of this work were presented by Meriam Saleh at the 60th Annual Meeting of the American Association of Veterinary Para- sitologists in Boston, MA, July 10-14, 2014, and the 64th Annual Meeting of the American Association of Veterinary Parasitologists in Denver CO July 14-17, 2018.
利益冲突声明
Anne M. Zajac has received honoraria from IDEXX and research sup- port from TechLab, Inc. Meriam N. Saleh received travel funds and partial stipend support from TechLab, Inc. David S. Lindsay has received research support from IDEXX. Joel F. Herbein is currently an employee of TechLab, Inc, and at the time the research was con- ducted, Jack R. Heptinstall was employed by TechLab, Inc.
标签外抗菌声明
Authors declare no off-label use of antimicrobials.
机构动物护理和使用委员会(IACUC)或其他批准声明
Authors declare no IACUC or other approval was needed. Fecal sam- ples were collected by animal owners or environments without animal handling.
人类伦理批准声明
Authors declare human ethics approval was not needed for this study.
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