欢迎关注WX公众号：可研Plus
2022年10月13日，Nature Biotechnology杂志(IF:68.16)在线发表了韩国基础科学研究所基因组工程中心Jin-Soo Kim团队的最新研究论文：“Precision mitochondrial DNA editing with high-fidelity DddA-derived base editors”。他们设计了高保真DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器(HiFi-DdCBE)，通过用丙氨酸代替分离的DddA之间的界面处的氨基酸残基，使得编辑器具有最小的脱靶活性。全线粒体基因组测序表明，与传统的DdCBE不同，传统的DdCBE会在人类mtDNA中诱导数百次不需要的脱靶编辑，HiFi-DdCBE高效且精确，避免了附带的脱靶突变，对于实现DdCBE在医学治疗中应用具有重要的意义。
为了实现更加特异DdCBE编辑，他们进行了本次探索。
DdCBE脱靶程度探索。进行了两组不同分割位点的对比，第一组：在1397残基处分割DddA，对比了可以配对的DddA(左右TALE-DddA)和单独一半DddA(仅左或右TALE-DddA组合无TALE的DddA)靶向目标位点的编辑效率，结果显示，成对的DddA可以实现有效的C-T编辑，C11位置效率可高达60.7%±3.2%；单独的一个TALE-DddA与未融合TALE的DddA也可以实现编辑，只是效率低一点，具体地，L-1397N和单独的R-1397C显示碱基编辑的频率分别为 31%±1.6% 和 8.1%±0.5%。第二组：在1333残基处分割DddA，对比内容类似第一组，结果显示，成对的DddA可以在C8位置可实现52.5%±3.2%的编辑，而每个单独的TALE-DddA组合未融合TALE的DddA在C8的碱基编辑频率为30.7%±1.7%(L-1333N)或17.5%±0.8%(R-1333C)。这些结果表明DdCBE会在只有一个TALE阵列可以结合的位点引起不需要的脱靶突变。因为TALE蛋白可以与一些错配位点结合，所以DdCBE可能会在细胞器或核基因组中诱导许多脱靶突变。
改造得到高特异性的HiFi-DdCBE。通过在分裂的DddA界面的一些氨基酸残基变为丙氨酸，一种具有化学惰性和非庞大侧链的氨基酸残基，从而抑制或防止自组装达到高特异性的目标。具体地，包含K1389A、T1391A、V1411A和T1413A等多种突变的变体在与野生型DdCBE结合时具有高度活性，但与无TALE融合的DddA结合时活性较差。例如，V1411A变体与野生型另一半组合的编辑效率为59.0%±1.1%，与野生型DdCBE对(60.7%±3.2%)相当，但与TALE-free组合时效率为2.2%±0.1%，表明C11位置的辨别力差异为26.9倍(59%/2.2%)。如上所述，野生型G1333分裂的DdCBE对显示出7.5倍的区分差异(60.7%/8.1%)。此外，这些变体比野生型DdCBE对更具选择性。因此，这些变体在编辑窗口中对C11的编辑优先于C8, C9和C13，而野生型DdCBE对的区分性要小得多，编辑所有四个胞嘧啶的高频率 > 6.6%(图1-b)。
HiFi-DdCBE避免了线粒体全基因组脱靶效应。1397N中的K1389A和T1391A、1397C中的V1411和T1413A，以及1333C中的K1389A、T1391A和V1393A这些突变在与野生型另一半配对时非常活跃，但在与无TALE另一半配对时效率低下。G1397位点分割的成对DdCBE靶向人MT-ND1基因检测其诱导脱靶突变，平均C-to-T编辑频率为0.0513%±0.0017%，比未处理的对照 (0.0023%±0.0001)高出22.5倍。但是，不含TALE、G1397分裂的DddA在mtDNA中也显示出0.0485%±0.0031%的平均转换频率，与野生型DdCBE对没有太大区别，表明即使在没有TALE-DNA相互作用的情况下也可以通过自发组装形成活性脱氨酶，这两个不活跃的一半也会导致附带突变(图2-a)。
最后，在实际应用中评估了HiFi-DdCBE，可以实现高特异性的编辑。例如：与野生型DdCBE相比，在1397N中具有T1391A突变的DdCBE对的平均脱靶编辑效率降低了5.0倍；与野生型对相比，1333C中具有K1389A突变的DdCBE对的平均脱靶编辑效率降低了6.0倍。
综上，新开发的HiFi-DdCBE具有更加特异性的编辑活性，可以更加高效实现目标编辑。