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2022年10月11日，JIPB杂志(IF:9.106)在线发表了朱健康院士团队的最新研究论文：“High-throughput genome editing in rice with a virusbased surrogate system”。文章中介绍了基于双生病毒介导代理系统，称之为WDV-Gate（Wheat Dwarf Virus-surrogate），以促进高通量的基因组编辑。WDV-Gate有两部分：一部分是来自转基因水稻系的受体愈伤组织，表达Cas9和一个突变的抗潮霉素基因（HygM）用于富集选择；另一部分是基于WDV的构建体，表达两个sgRNAs，分别靶向HygM和感兴趣的基因。通过总共874株T0植物，在6个水稻基因座上评估了WDV-Gate，与传统方法相比，WDV-Gate系统的特点是sgRNA的瞬时高水平表达，显著提高了编辑频率(66.8% vs. 90.1%)，组培苗再生效率增加2.31倍，以及同源编辑植株的数量(36.3% vs. 70.7%)。使用汇集的针对SLR1基因的sgRNAs进行大规模编辑的结果是94.4%的高编辑频率，进一步证明了其可行性。此外，利用此策略成功实现3xFLAG肽融合到三个基因座上，效率高达13%。
设计WDV-Gate系统。双生病毒的高转化效率和自我复制特性可能使WDV成为传递基因组编辑元件的有效工具。但是基于WDV的载体容量有限，不能递送完整的Cas9系统，所以分了两步，第一步，基于WDV的载体用于高效表达sgRNA，分别靶向目标基因及突变的潮霉素基因(图1-A)；第二步，HygM代理载体，表达Cas9和缺失了1bp的潮霉素基因(图1-E)。首先用第二步的载体产生稳定转化的株系，稳定株系的下一代用第一步的WDV载体再侵染，这样就形成了可以发挥作用的sgRNA和Cas9，且恢复潮霉素抗性以富集编辑。在测试中，将WDV-Gate03转入稳转株系中潮霉素突变恢复效率达56%，编辑效率指示的荧光蛋白也显示出强烈的信号(图1C)。当转化HygM愈伤时，WDV-Gate03也比传统的T-DNA系统(pCBSG032)产生更多的抗潮霉素愈伤(图1-D,F)，表明使用WDV-Gate03进行基因组编辑的可行性。
图1
利用WDV-Gate编辑水稻基因组。选择六个内源基因，与传统的T-DNA系统相比，WDV-Gate03可以显著提高遗传转化效率，平均提高2.31倍(523 vs 226)。对T0幼苗的基因分型显示，WDV-Gate03在所有六个内源性目标位点的突变频率也比常规T-DNA系统高，平均提高了1.35倍(90.1% vs 66.8%)。最高的提高是在PT1基因座的2.03倍(78.6% vs 38.7%)(图1-G)。此外，与传统的T-DNA系统相比，WDV-Gate通过产生更多的纯合型/杂合型和更少的嵌合体，导致植物组织的同质性增加(图1-G)。尽管传统的T-DNA系统可以产生高效率的同源突变，但WDV-Gate的表现要好得多(36.3% vs. 70.7%,图1-G）。基于这些结果，WDV-Gate有潜力提高高通量基因组编辑。
WDV-Gate介导高通量基因编辑。设计了42个sgRNAs来编辑SLR1基因的DELLA结构域(图2-A)。这些sgRNAs的寡聚物被合成并构建到WDV-Gate03中以建立一个质粒库。然后用农杆菌将这个文库大量转化到HygM愈伤中(已完成第二步载体的侵染,图2-A)。共再生了126株幼苗，Sanger测序结果显示，有119株幼苗含有indels，表明WDV-Gate的靶向突变频率为94.4%。此外，101株(84.9％)具有独特的基因型，这表明WDV-Gate产生了独立的事件。DSDecode分析显示，41株(34.5％)是同源突变体，49株(41.1％)是双等位基因突变体，表明编辑的纯度很高。此外，82株(68.9％)没有WDV基因整合，表明WDV-Gate瞬时表达的sgRNAs可以有效地产生编辑事件。大部分被编辑的植物是纯合型/杂合型(75.6%)，可以很直观地在表型中观察到(图2-B,C),这些结果进一步证实了使用WDV-Gate进行高通量编辑的可行性。
最后WDV-Gate策略结合化学修饰的Donor通过共转化实现了最高13%的定向序列插入。
图2
综上，本研究开发了基于双生病毒的代理筛选系统，可以实现更加高效的高通量基因编辑以及定向序列插入，结果表明WDV-Gate可用于基因功能剖析和农作物遗传改良。
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