作者有话说
作者陈昌福，华中农业大学水产学院《水产动物疾病学》教授、日本国爱媛大学理学博士，具有从事水产动物疾病学研究与教学数十年的经历。
刚过去的几天，我们通过《农财宝典-大国渔业》微信公众号平台，先后发布了两篇文章（回顾请点击以下链接）↓↓↓
在上述两篇文章发布后，还是有一些从事水产养殖的朋友通过在文章后留言或者直接来电话和信息询问我们↓↓↓
“新冠检测也是这样的检测原理，阳性马上隔离，咋回事？”
“为什么新冠病毒却以核酸检测来筛选？”
“如何证明饲料中的核酸片段没有活性，该文章并没有说明啊，有活性照样具有传染性！”
“你怎么证明病毒检测出来只是片段？怎么排除没有漏洞病毒到虾体不复阳？你确定所有虾料都经过熟化？”
“检测报告出来了还不诚（承）认，为什么这些专家以前知道不告诉我们养殖户，难道是和厂家合作，欺骗养殖户......难怪这些年越来越难养的原因之一。”
还有一些与我们比较熟悉的文章读者，直接来电话询问我们↓↓↓
“PCR技术不能检测活病毒吗？”
“饲料饲料中如果有病毒，不会浸染健康对虾吗？”
为了回复上述的一些相关问题，我们准备利用这篇文章简要地介绍DNA和PCR的基本概念。籍以说明为什么通过对饲料中WSSV的DNA监测的结果，不能用于判断饲料中是否带有活着的WSSV，为什么用对虾饲料作为监测对虾病毒病的材料是不科学的。
简述DNA与PCR——再议用饲料监测对虾病毒病不科学
文/华中农业大学教授陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军
在前一篇文章中，就已经清楚地说明了我们撰写并发布文章的目的，就是因为有个别水产动物病害监测机构，利用荧光定量PCR（polymerase chain reaction）技术，从对虾饲料中检测到对虾白斑综合症病毒的遗传物质（DNA）。
在添加有鱼粉的对虾饲料中检测到对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的DNA片段，原本是一个很容易理解和解释的检测结果，凡是具备一些现代生物学知识的人们都会明白，对于这种检测结果唯一正确地解释就是，用于制作对虾饲料中鱼粉的鱼类，在其活着的时候曾经接触并且携带了WSSV。人们在利用这些携带WSSV的鱼类制作鱼粉时，活体的WSSV虽然因为在鱼粉制作过程的加热处理工序中被杀死了，已经彻底失去再浸染健康对虾的机能，但是，作为WSSV遗传物质DNA却会存在于鱼粉中的。
一些对虾养殖业者由于缺乏相关的现代生物学知识，在见到从对虾饲料中检测到WSSV的DNA的检测报告后，担心自己养殖对虾会因此感染上对虾白斑综合症病毒病（white spot syndrome virus disease，WSSVD），这种担忧的心情是可以理解的。
01
DNA
1944年，奥地利物理学家艾尔温·薛定谔（Erwin Schrödinger，1887~1961）在其撰写的《生命是什么？—活细胞的物理学观》一书中，非常清楚地表达了一个概念：生命的基本特征就是能否储存和传递信息，即遗传密码能够代代相传，基因是活细胞的关键组成部分，要懂得什么是生命，就必须知道基因（gene）是如何发挥作用的。
生物学家们将“承载遗传信息的最小单位”称为“基因”。但是，直到1953年之前，科学家们尚不知道“基因”到底是什么样子，它“寄存”在哪里？当时，位于细胞核中的染色体（chromosome）已经被证明了在遗传过程中具有关键作用。而且知道了染色体主要是由脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和蛋白质组成，而且染色体中含有的蛋白质要较DNA多一些。
与此同时，有人利用细菌的转化试验结果证实，在结构上远不如蛋白质复杂的DNA，实际上是细菌中的遗传物质，在决定各种细菌的遗传性状方面起着关键性的作用。进一步地研究结果还证明了，所有生物均包含有DNA分子，而且是储存制造蛋白质的遗传指令分子。
此时，人们就需要知道遗传物质DNA的本质是由什么组成的，它们是怎么做到精确复制、控制蛋白质合成过程的？也就是说人们继续对DNA的化学与物理构造有更多的了解。
人们首先弄清楚了DNA是由核酸的单体聚合而成的聚合体。即1分子含氮盐基+1分子五碳糖（脱氧核糖）+1分子磷酸根。核酸的含氮碱基又可分为四类：鸟嘌呤（g）、腺嘌呤（a）、胞嘧啶（c）和胸腺嘧啶（t）。DNA的4种含氮碱基比例具有奇特的规律性，是染色体的主要化学成分，每一种生物体DNA中，4种含氮碱基组成具有物种特异性。即4种含氮碱基的比例在同物种不同个体间是一致的，但是在不同物种间则有差异，由此决定了不同物种的遗传特异性。
关于DNA的物理结构，这项堪称人类生命科学史上拥有里程碑性质的伟大发现，不久就由两个年轻的科学家完成了。1953年4月25日的《自然》杂志上，发表了英国生物学家、物理学家、神经科学家弗朗西斯·哈利·康普顿·克里克（Francis Harry Compton Crick，1916~2004）和美国生物学家詹姆斯·沃森（James Watson）共同发现的关于脱氧核糖核酸（DNA）的双螺旋结构（图1）的文章。二人也因此研究成果与英国分子生物学家莫里斯·汉·弗里德里克·威尔金斯（Maurice Hugh Frederick Wilkins，1916~2004）共同获得了1962年的诺贝尔生理及医学奖。
图1 示DNA的双螺旋结构
正是由于实现了对DNA理化特性的科学阐释，标志着生物科学进入到了分子生物学时代。由于对作为生命体遗传物质DNA的化学、物理结构的深入了解，可谓是人类实现了能科学地解读生命的密码了。近几十年来，人类尤其是人们在进行动、植物的遗传育种研究、人类医学以及一切涉及到生命科学内容的研究，甚至是在考古生物学的研究工作中，都毫不例外涉及和利用到了DNA的研究成果以及分子生物学技术。
由于阐明了作为生物遗传物质DNA理化特性，实现所谓“分子育种，molecular breeding”才有了可能，分子育种专家们只要对某种生物的DNA链条中的某个片段进行置换（育种专家通常将这种做法叫做“分子杂交，molecular hybridization”），就可能改善某种生物的遗传性状了。也正是DNA理化性状非常稳定并且具有物种特异性，考古生物学家才有可能在数百万年前的化石中，根据DNA的结构特点鉴定出数百万年的生物种类。
02
PCR
简而言之，所谓PCR技术的基本工作原理，就是模仿天然条件下的DNA复制过程，其技术的关键点是设计特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
所谓PCR操作技术，就是在特定的所谓PCR仪中，完成DNA的变性—退火—延伸3个基本反应步骤构成。
第一步，是模板DNA（如果是为了检测某种病原生物，所谓“模板DNA”就是这种病原生物的DNA）的变性：模板DNA经加热至93℃左右并维持一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下一轮反应作好准备；
第二步，模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至55℃左右，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
第三步，引物的延伸：DNA模板—引物结合物在72℃、在DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，以靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链（图2），重复循环变性—退火—延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环至需要2~4min，2.0~3.0h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
图2 示DNA的半保留复制过程
上述PCR技术的最大特点，是能将检测样品中存在的微量DNA大幅度地增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中由凶手所遗留在作案现场的毛发、皮肤或血液，只要能分离到一丁点儿的DNA，就能利用PCR技术将DNA加以增量，进行比对研究。这也就公检法部门常说的所谓“微量证据”的威力之所在。
需要各位读者注意的是，作为现代分子生物学经典技术之一的PCR技术，虽然具有样品需求量少、检测准确度高等诸多优点。但是，因为检测的是检测材料中存在的所有生物的遗传物质DNA，有点是只要检测样品即使只存在及微量的DNA，也能利用PCR技术将其检查出来，不足之处是检测到样品中的DNA，究竟是来自现在尚活着的某种生物，还是来自已经死亡生物体的遗骸，PCR技术是无法区分并做出自行判断的。对这种结果的判断是需要具有相关专业知识的技术人员完成的。
03
答疑
3.1新冠检测也是这样的检测原理，阳性马上隔离，咋回事？
答：用分子生物学技术检测人体的新冠病毒，都是从活着的人体的咽喉或其鼻腔中用棉拭子取样的，如果在样品中检测到了新冠病毒的DNA，将其判为阳性。说明被检测人体内可能携带了活的病毒，为了避免携带病毒通过带毒者的呼吸道等传染给密接者，采取对阳性检出者的隔离措施是有必要的。
3.2为什么新冠病毒却以核酸检测来筛选？
答：因为检测核酸的技术（如PCR技术）需要样品量少、操作简便、准确率高。
3.3如何证明饲料中的核酸片段没有活性，该文章并没有说明啊，有活性照样具有传染性！
答：首先，“活性”和感染能力是不同的概念。另外，病毒的核酸（DNA）片段虽然来自病毒，但是，肯定不是病毒。而只有活病毒才有可能具有浸染能力，核酸（DNA）片段没有侵染能力。
3.4你怎么证明病毒检测出来只是片段？怎么排除没有漏洞病毒到虾体不复阳？你确定所有虾料都经过熟化？
答：因为采用的是PCR检测技术，只能检测到DNA片段。因为检测的是经过高温加工过的对虾饲料，其中不可能有活着的且能浸染健康对虾的病毒。如果不是经过加热熟化的对虾饲料，就不属于我们讨论这个问题的范围之中了。问题是检测部门检测的材料就是经过加热、熟化的对虾饲料。
3.5检测报告出来了还不诚（承）认，为什么这些专家以前知道不告诉我们养殖户，难道是和厂家合作，欺骗养殖户......难怪这些年越来越难养的原因之一。
答：自始至终，没有任何人“不承认”检测结果。我们只是说用对虾饲料检测危害对虾的致病性病毒，采样本身是错误的，检测结果是没有意义的。我们在文章中提到的这些基础知识书本上都有的，而这些专业书大多是专家撰写的，养殖户也是要看了这些书才能知道这些常识的啊？如果将养不好对虾的问题，都归结为是因为专家没有讲清楚的话，养殖户自己干什么去呢？这种问题出现后，我们好心地写几篇小文章，期望阐明一些实际问题，却被您等看作是在“和厂家合作，欺骗养殖户”！
唉，想为您等养殖业者做点专业服务工作，也实在是太难了啊！
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作者：华中农业大学教授陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军
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