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近日，知名预印本平台bioRxiv在线发表了韩国中央大学Seung Hwan Lee课题组题为“Highly precise genome editing using enhanced CRISPR-Cas12a nickase module”的研究论文。他们使用增强的CRISPR-Cas12a缺刻酶系统在特定的排列方向和缺刻酶分布距离下有效地将突变引入到人类基因靶位点中。双模式Cas12a缺刻酶系统可比野生型Cas12a诱导的靶向特异性提高10.5~12.5倍。通过以单模或双模有效诱导靶基因突变，Cas12a缺刻酶解决了Cas9缺刻酶的局限性，并有望为未来基因组编辑技术的发展做出贡献。
利用Cas9活性位点工程化改造产生的缺刻酶型式目前在各个领域越来越重要，例如碱基编辑或引导编辑。然而，对于其他类型的Cas蛋白，特别是Cas12型，在靶DNA上诱导缺刻的机制尚不清楚。
确认en-AsCas12a (R1226A)的缺刻特性。他们基于en-AsCas12a改造得到en-AsCas12a (R1226A)。在体外利用不同Cas12变体酶切含有目标靶位点的质粒（图1-b），en-AsCas12a（R1226A）表现出了以缺刻酶切割为主的活性（图1-c）；然后利用Cas12a（R1226A）变体与SpCas9（D10A）或SpCas9（H840A）共同处理目标质粒（图1-d），他们发现仅在Cas12a（R1226A）变体和SpCas9（D10A）缺刻酶共同处理时才形成双链断裂（图1-e），以此确认AsCas12a（R1226A）缺刻非靶向链（NTS）
图1
确认双模Cas蛋白缺刻酶的排列方向性。对于SpCas9（D10A）和en-AsCas12a（R1226A）缺刻酶的每种组合结果分析后发现，PAM-out方式诱导的插入频率（EMX1平均为12.4%，CCR5为5.8%）（图2 a，c，e）高于PAM-in方式（EMX1平均为0.9%，CCR5平均为1.0%）（图2 b，d，f）。随着缺刻酶组合的PAMs之间的距离增加，总的indel频率降低（图2）。
图2
单双模式的AsCas12a（R1226A）编辑效率对比。wt-enCas12a的突变频率最高（EMX1的平均率为37.6%，CCR5的平均突变率为10.8%），其次是双Cas12a（R1226A）（EMX1的平均6.6%，CCR5的平均3.5%）和单Cas12a（R1226A）（EMX1的平均2.1%，CCR5的平均0.6%）（图3）。
图3
单双模式的AsCas12a（R1226A）靶向特异性对比。最后依据On-target/off-target评估了靶向特异性，在对三个靶位点的比较中，野生型en-Cas12a平均编辑效率为59.6%，而双模式AsCas12a（R1226A）为15.5%，单模式AsCas12a（R1226A）为6%；相比之下，对于选定的脱靶位点，双和单en-Cas12a（R1226A）变体诱导了0.06%和0.17%的InDel频率，而野生型en-Cas12a诱导的InDel频率为6.4%（图4b，d，f）。双模式en-Cas12a（R1226A）变体（提升11.6倍）和单模式en-Cas12a（R1226A）变体（提升3倍）相较于野生型具有更高的靶向特异性。
图4
本文提出了一种基于CRISPR-Cas12a系统的单或双切口靶基因编辑方法。研究结果表明，在体内通过单一缺口生成安全地诱导突变的可能性，这与在诱导DNA双链断裂后使用同源定向修复和非同源末端连接进行校正不同。此外，它还为替换或补充源自先前基于G-rich PAM识别的CRISPR-Cas9 缺刻酶的技术提供了基础，例如碱基编辑或引导编辑。这项研究有望通过解决现有基于Cas9缺刻酶方法的局限性，为在各种生物系统中诱导安全有效的基因编辑做出贡献。
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