近日，analytical chemistry杂志（IF:8）在线发表了上海交通大学杨立桃、张大兵教授合作的文章：“One Versatile Cas9-Integrated Single-Tube Duplex Quantitative Real-Time PCR System for Rapid Analysis of CRISPR/Cas-Induced Mutants”。他们开发了一种由体外CRISPR/Cas9裂解辅助的单管双联定量实时PCR（Cc-qPCR）方法，以筛选出预期的基因编辑系，识别基因型，并评估基因编辑频率。在Cc-qPCR中，基因组DNA首先被单向导RNA（sgRNA）/Cas9复合物在目标位点裂解，然后用qPCR定量，以评估突变体的存在并确定样本的基因型。研究结果表明，Cc-qPCR可以成功地识别具有小的插入或缺失（indels）的突变体，甚至在具有单碱基indels或替换的突变系中也是如此。Cc-qPCR还能够成功地识别杂合子和同合子的突变体。Cc-qPCR的灵敏度被确定为低至0.5%，表明该方法可用于评估基因编辑系统的编辑效率。
该方法巧妙地结合了Cas9-sgRNA靶向以及qPCR，体外表达的sgRNA（和载体构建的sgRNA是同一个）和Cas9进行靶向切割需要检测的基因组DNA，然后将预处理后的基因组DNA进行qPCR检测。如果是野生型，那么就可以将两条染色单体上的DNA均切开，在后续qPCR时得不到产物；如果是杂合突变，就会有一半可以正常扩增，产量相对于WT增加一半；如果是纯合突变，那么两条染色体上的DNA均可以正常扩增；以上三种结果反映在qPCR曲线上就是三种不同的状态，加上用于标定的SPS位点，进而可以进行快速检测突变情况。（图1）
关于检测精度：文中有专门探索，Cc-qPCR的灵敏度低至0.5%；
关于基因编辑频率：计算公式为y = −3.422x + 0.7344，其中x为Ct(Cycle Threshold)；
关于体外靶向切割体系：sgRNA最适浓度为150 nM；Cas9最适浓度为30 nM；反应时间不少于30分钟。
图1 Schematic of the Cc-qPCR principle
总之，该文章报道了一种全新的Cc-qPCR方法用于检测基因编辑后代，并证实了在未知突变体筛选、基因型鉴定和基因编辑频率评估中的适用性。Cc-qPCR具有高分辨率、高精度、实验操作简便等优点，是一种独特的CRISPR/Cas9诱导的突变体检测方法，可用于加速分子育种环境中突变体的快速、准确筛选。Cc-qPCR也有可能被用于许多其他研究领域的目标分子的检测和诊断。
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