2022年8月2日，哈佛大学George Church教授团队、中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所刘陈立研究员团队在Nature Communications上发表了题为Multiplex base editing to convert TAG into TAA codons in the human genome的文章，研究利用多重复合的碱基编辑技术在人类基因组中将TAG转换为TAA。该团队开启了人类全基因范围内TAG终止密码子转换为TAA，初步证明了TAG转换为TAA在人类基因组中的可行性，同时创造了一次递送在人类基因组中数十个非重复位点同步碱基编辑的记录，为哺乳动物基因组的大规模工程化改造提供了一个工作框架。此外， GRIT软件也可以被开发成一个新的计算机辅助设计 (CAD) 平台，用于设计编写大规模的基因组。该研究迈出了基因组重编码制备抗多种天然病毒人类细胞系的第一步，为哺乳动物基因组多重复合编辑和GP-write路线图的制定奠定了基础。
虽然读取DNA密码的技术不断进步，但科学家们编写DNA密码的能力仍然有限，这限制了其理解和操纵生物系统的能力。为了进一步了解生命蓝图，开发有助于大规模合成和编辑人类和其他物种基因组的工具和方法变得尤为重要。因此，2016年Jeff Boeke和George Church教授等提出了基因组编写计划（GP-write project），旨在从被动读取基因组转向主动编写基因组【1】，也被认为是人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）的下一代基因组计划（HGP-write）。GP-write计划将促进利用生物工程来解决人类面临的许多全球问题，如病毒感染、濒危物种增多，气候变暖等。随后，科学家们组建了由全球科学家们共同参与的工程生物学卓越中心（Center of Excellence for Engineering Biology: https://engineeringbiologycenter.org/），并于2018年提出了基因组重编码来构建抗病毒人类细胞系，作为GP-write的第一个里程碑式的试点项目，该项目也被明确地限制在细胞和从细胞衍生的类器官中开展。
那如何通过基因组重编码制备抗病毒人类细胞系呢？理论上，如果替换掉所有基因中的一个冗余密码子 (或“重新编码”基因) ，并去除解码它的tRNA，人类细胞仍然可以制造它所有的蛋白质。但病毒的基因仍然包含这个冗余密码子，并且依赖宿主细胞机制进行复制，这样病毒将无法将它们的基因转化为蛋白质，使得试图复制的病毒被消灭，因此，基因组重编码的细胞将具有了免疫力，这个概念已经在大肠杆菌中得到验证【2,3】。但在人类细胞中是否能实现呢？在本研究中作者提出了一个潜在方案来制备抗病毒人类细胞系：在全基因组范围内将终止密码子TAG转化为TAA，并将内源性真核释放因子1 (eRF1) 替换为具有选择性通读的工程化eRF1突变体，使得人类细胞系具有抗病毒的能力(图1)。
图1 抗病毒细胞系制备示意图
地球上大多数生物体共用64个三联体密码子，其中61个密码子可以编码20种天然氨基酸和3个密码子作为终止信号。在20种氨基酸中有18个由一个以上的同义密码子来编码，被称为遗传密码子的简并性。基因组重新编码技术就是通过基因组工程手段进行同义密码子替换，将“冗余”密码子去掉，并赋予这些被去除密码子（“空白”密码子）新编码能力的技术。通过基因组重编码不仅可以赋予了生物体或细胞抗病毒的能力，也可以重新赋予“空白”密码子新的功能，包括非标准氨基酸的整合和生物防护。2013年Church 实验室首次在大肠杆菌通过TAA取代TAG终止密码子并删除释放因子1 (RF1)，使得其具有抗病毒的能力【2】。2021年，Jason Chin 实验室在大肠杆菌全基因组范围内实现用同义词密码子替换两个有义密码子和一个终止密码子，并删除相应的转运RNA (tRNA) 和释放因子，使得该大肠杆菌码子具有抗多种病毒和遗传编码非标准的氨基酸的能力【3】。此外，基因组重编码设计也正在酵母基因组SC2.0计划中实施【4】，但在人类全基因组范围内进行基因组重编码是否可行呢？本研究中，研究人员首次提出了在人类全基因组范围内将TAG终止密码子转换为TAAs的工作框架（图2）。首先，作者们开发了一个软件GRIT来解析基因组数据，识别人类基因组中所有的TAG密码子，并为碱基编辑器设计gRNAs，引导它们转换为同义密码子TAA。虽然该软件只在人类基因组数据上进行了测试，但它可以用于其他具有高质量参考基因组和充分注释的真核生物，如小鼠和果蝇等。随后，他们开发了高效的TAG到TAA转换方法，通过多个gRNA阵列递送与CBE单碱基编辑器【5】及其报告荧光分子，使高编辑的细胞得到富集。此外，作者们还通过单细胞RNA测序（scRNAseq）分析了细胞群体中单细胞中多重复合碱基编辑的结果。最后，他们通过全基因组测序、转录组测序和核型分析等手段对那些高基因组修饰的单克隆进行了评估。
图2 TAG终止密码子转换为TAA的工作框架
人类基因组重编码是一个系统而复杂的基因组工程。虽然本研究可以通过一次转染在单个克隆中实现多达33个基因位点编辑，但这还远远不够。为了使以TAG作为终止密码子必需基因或全部的基因，都可以转换为TAA，作者在文章的讨论部分，提出了几种可能的优化工作框架的策略:1)基于CBE变体(PMIDs:33247095,32345976,32424272)、引导编辑器(PMIDs:31634902,34653350)和DdCBE (PMIDs: 32641830,35379961)开发低脱靶、高编辑效率的新型碱基编辑器。2)增加BAC或YAC载体上的gRNA阵列和sgRNA池，提高sgRNA的递送能力。3)通过RNP (PMID:28585549) 和同步转染等新的递送方法(图3)。基因组重编码的人类细胞一旦完成，将提供一个独特的具有扩展功能的底盘细胞，可广泛应用于生物医学，特别是用于制造细胞疗法或治疗生产线，来抵抗大多数天然病毒的感染。
图3 潜在优化TAG终止密码子转换为TAA工作流程的方法
哈佛大学George Church教授、中科院深圳先进院合成所刘陈立研究员与哈佛大学医学院Eriona Hysolli博士为共同通讯作者。中科院深圳先进院合成所陈宇庭博士（前哈佛医学院Church lab 博士后研究员、现中科院深圳先进院合成所助理研究员与执行课题组组长）、Eriona Hysolli博士、陈安璐博士和Stephen Casper为共同第一作者。哈佛大学刘松雷博士和Kevin Yang等对论文的实验做出了重要贡献。
https://www.nature.com/articles/s41467-022-31927-8
制版人：十一
参考文献
1, Boeke, J.D. et al. GENOME ENGINEERING. The Genome Project-Write.Science353, 126-127 (2016).
2, Lajoie, M.J. et al. Genomically recoded organisms expand biological functions.Science342, 357-360 (2013).
3, Robertson, W.E. et al. Sense codon reassignment enables viral resistance and encoded polymer synthesis. Science 372, 1057-+ (2021).
4, Richardson, S.M. et al. Design of a synthetic yeast genome.Science355, 1040-1044 (2017).
5, Thuronyi, B.W. et al. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity.Nat Biotechnol37, 1070-1079 (2019).
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