撰文 | 望夜
不断出现的新变异毒株提示我们新冠疫情仍在全球大范围流行，病毒的认识之旅仍在路上。对病毒宿主因子的认识，有助于理解病毒-宿主互作及新冠疾病。
2022年7月25日，加州大学伯克利分校Eva Harris、Patrick D. Hsu与斯坦福大学医学院Silvana Konermann领导的研究团队在Nature Genetics合作发表题为Genome-wide bidirectional CRISPR screens identify mucins as host factors modulating SARS-CoV-2 infection的研究长文，通过基因组水平的CRISPR敲除和激活筛选，发现高度相互关联的原病毒和抗病毒因子宿主通路，涉及网格蛋白运输、炎性信号、细胞周期调节、转录和表观调节。此外还发现黏蛋白（mucin）是一种重要的宿主限制因子，可在体外和小鼠水平抑制病毒感染，还可抑制多种呼吸道病毒的感染。
众所周知，新冠病毒利用宿主细胞表面的血管紧张素转换酶II（ACE2）受体感染。为有效入侵宿主，病毒囊膜上的S蛋白需要经过宿主表面跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的切割；或当TMPRSS2缺失时，在内吞过程中会被溶酶体中的组织蛋白酶（CTSL）酶切。在肺上皮细胞中，由TMPRSS2介导的细胞表面入侵占主，因此抑制TMRPSS2可有效防止新冠病毒入侵肺上皮细胞【1】。新冠在人体感染的大部分细胞都同时表达ACE2和TMPRSS2，如下呼吸道、上呼吸道、鼻腔和肠道的上皮细胞。
病毒感染周期涉及多种宿主因子的作用，它们或者发挥正向调节作用，或者发挥负调节作用。近期，通过功能缺失（loss-of-function，LOF）实验已发现一系列宿主因子，但这些研究要么是在非上皮细胞系中进行，要么是在缺乏ACE2和TMPRSS2表达的细胞中进行的。而且，功能缺失实验发现的往往是原病毒相关宿主因子，功能获得（gain-of-function，GOF）实验则可发现抗病毒因子，即介导病毒限制的基因。因此，采用双向筛选策略，可以同时发现病毒依赖的和潜在抗病毒的宿主因子。在本研究中作者选择使用一种人源肺细胞Calu-3细胞株，其可内源性表达ACE2和TMPRSS2。
发现原病毒和抗病毒宿主因子
作者首先进行LOF和GOF CRISPR筛选（图1），使用的是前述Calu-3细胞，它极易被新冠病毒感染并出现细胞病变（CPE）。LOF和GOF筛选均采用3-4个生物学重复，并保证超过1000×向导RNA（sgRNA）覆盖。病毒感染5天后，当细胞出现70%以上CPE时，收获细胞、提取基因组DNA，使用二代测序检测sgRNA靶向的富集或删除基因。LOF-富集到的、GOF-删除的是原病毒相关基因，而GOF-富集到的是抗病毒相关基因。两组分析中得分最高的基因均为ACE2，TMPRSS2在LOF筛选中也被高度富集。此外，LOF富集分析中的高分基因还包括AP1G1（编码一种网格蛋白适配体）、CHUK（编码NF-κB信号途径中的IKK-alpha）；在GOF-删除筛选到的是NFE2（编码一种转录因子）、TRAF3IP2（编码一种E3泛素连接酶）。在抗病毒基因方面，GOF筛选鉴定出TEAD3（编码一种参与调节细胞增殖的转录因子）、CCNE1（编码细胞周期素E1，是G1/S期转变必需的）、ZNF275（编码一种锌指蛋白，可能参与转录调节）为得分最高的三个基因。综上，病毒入侵和转运因子、促炎症反应和细胞增殖调节相关组分是决定新冠病毒介导的Calu-3细胞死亡的关键决定因素。
图1 本文的双向筛选策略示意图
宿主依赖的通路和互作网络
接下来，作者着重对两组筛选中得分前100位的基因进行分析。首先进行蛋白互作网络分析，确定可能的相互作用并将其归类。其次，使用基因集合富集分析确认富集到的通路。作者发现，凋亡通路直接参与病毒介导的CPE形成，而经典的干扰素通路可通过调节细胞增殖或死亡通路影响CPE。此外，NF-κB介导的炎症通路、细胞连接复合物、细胞骨架重塑、适配体介导的网格蛋白运输和细胞周期调节等通路均被富集到。
为确定特定基因对新冠病毒感染的影响，作者分别构建出LOF富集和GOF删除后得分前5的基因敲除细胞株，并进行病毒感染，发现当ACE2、TMPRSS2、AP1G1、CHUK、ROCK1、RIPK4、TAOK2基因被破坏时，产生的可感染性病毒减少。其中，RIPK4和CHUK属于NF-κB通路，说明该通路的某些组分有助于病毒感染，并可能被病毒正向调节以促进其复制。为确定GOF删除结果，作者使用慢病毒介导的CRISPR激活组分确认上调ACE2、NFE2、TRAF3IP2、TRDMT1可不同程度增加病毒感染。此外，可增加病毒感染的基因还包括MEX3B、APOL1和CDKN2B，其中CDKN2B编码细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂2B，控制着G1期向S期的进展；APOL1编码网格蛋白适配体复合物AP1的亚基，作者推测其为病毒入侵过程必需，因为网格蛋白介导的内吞作用是病毒入侵途径之一。假病毒入侵实验也证实该推论。
肺上皮细胞中的独特依赖组分
作者接下来比较LOF筛选结果与近期发表的其它新冠LOF筛选结果，发现筛选到的共有基因在前100种中不超过4种。作者发现感染病毒所用的细胞类型决定了筛选结果。尤其前述AP1网格蛋白适配体组分仅出现在本研究及近期一项同样在Calu-3细胞中进行的筛选中【2】，这种差异凸显CTSL-和TMPRSS2-依赖的入侵和转运途径的差异。因此，在新冠病毒经TMPRSS2途径入侵过程中，调节内吞体成熟和CTSL功能的宿主因子可能是非必需的。
为分析本研究筛选到的基因的生理相关性，作者比较了最近发表的两项scRNA-seq研究结果，一项来自新冠肺炎病人支气管肺泡灌洗液的数据集【3】，另一项来自健康人肺细胞的综合分析【4】。作者发现新冠肺炎病人的肺上皮细胞表达谱与健康人不同，将前述100个高得分基因与其比较，发现它们大多在新冠病体内表达水平也比较高，尤其是炎症相关（B2M、TAOK1）和细胞增殖相关（ELF3、TPT1、NUPR1）基因。随后，作者聚焦在共表达ACE2和TMPRSS2的纤毛上皮细胞的RNA-seq数据，这种细胞被认为是新冠病毒感染人体的首要靶细胞。作者再次发现与之前Calu-3中分析结果的吻合，说明Calu-3细胞更能代表生理条件下人体肺部同时表达ACE2和TMPRSS2的细胞。这里，重合的基因包括调节细胞增殖和迁移的（TMC5、ST14、KLF5）及细胞粘附的（CDH1）。最后，对照健康人与新冠病人支气管肺泡灌洗液数据，作者发现在Calu-3中高得分的基因正是病毒感染上皮细胞后表达调节最高的。总之，宿主因子是细胞类型特异性的，TMPRSS2表达与否决定了病毒通过哪条通路感染，Calu-3细胞中富集到的基因更能代表生理条件下人体肺上皮细胞的情况。
新冠病毒的宿主限制因子
GOF筛选可以提供宿主抗病毒因子的系统分析，即过表达可以限制病毒复制的基因。作者通过通路和蛋白互作网络富集分析发现，炎症通路、G蛋白偶连受体（GPCR）通路、转录调节、细胞周期调节和黏蛋白是关键抗病毒通路。作者选择GOF中得分最高的5个基因及上述通路中的代表基因，包括编码G1-S期检查点调节子CCNE1、多种转录调节子（TEAD3、ZNF275、SPDEF、JDP2、TAF7L、ZNF248、MRGBP）、宿主解旋酶（DDX28）、离子通道（TMEM206、SLC44A2）、细胞连接调节子（DOCK4）及膜结合蛋白（CPNE3）。分别对这些基因的Calu-3过表达细胞株进行病毒感染实验，病毒滴度出现下降，表明上述基因存在抗病毒作用，但过表达ZNF275不会影响病毒载量。
CCNE1编码的是促进细胞进入S期的蛋白，其作用与前述CDKN2B一致，后者编码细胞周期抑制剂，其上调会增加病毒复制。通过调整周期蛋白与CDK互作来调节细胞周期的方式在其他冠状病毒中也曾有报道【5】。TEAD3和JDP2可能也通过调节细胞增殖对病毒起关键作用。转录因子SPDEF对杯状细胞的分化十分关键，后者参与粘液分泌。其余如DDX28已被证明与新冠N蛋白存在互作，CPNE3曾报道与SARS nsp1和RNA存在互作，IRP5是干扰素途径中的抗病毒蛋白。
黏蛋白是一类带有高度O-糖基化修饰的高分子量蛋白，是肺部和肠道上皮束粘液内壁的主要组分。在GOF富集分析中，膜锚定黏蛋白（MUC1、MUC4、MUC13、MUC21）形成一个庞大且相互连接的网络。此外，乙酰氨基葡萄糖转移酶（B3GNT6）及细胞表面蛋白CD44和ICAM1也出现在筛选结果中。由于定位于肺部、在抗病毒通路中被富集、此前未被报道，作者将关注重点锁定膜锚定的黏蛋白。
膜锚定黏蛋白限制新冠病毒感染
作者分别构建出MUC1、MUC4、MUC13、MUC21、CD44 GOF Calu-3细胞株，发现均可导致病毒载量降低。其中，CD44与MUC1互作，且可通过可变剪接带有一个黏蛋白样结构域。作者随后使用选择性切割黏蛋白的酯酶抑制剂（StcE）处理细胞，发现感染后24小时的病毒滴度明显增加，说明缺乏内源性黏蛋白的肺细胞更易被病毒感染。作者接着分析已发表的新冠病毒感染后肺组织RNA-seq数据中黏蛋白的表达情况，发现在感染后2天至2周内，黏蛋白持续上调表达，特别是在新冠病人肺泡灌洗液中的上皮细胞组分中，全部四种跨膜黏蛋白及CD44均显著上调。作者还发现，MUC1在含有新冠病毒RNA的细胞中的表达量更低。总之，黏蛋白上调是一个广谱的抗病毒宿主反应。
作者还测试了MUC1和MUC4 GOF Calu-3细胞株感染不同临床株——alpha (B.1.1.7)、beta (B.1.351)、gamma (P.1)、epsilon (B.1.429)及WA/1突变体的情况，发现过表达任何一种黏蛋白均可限制病毒突变株的复制。作者还发现使用StcE处理会显著增强细胞对包括delta（B.1.671.1）在内的各突变株的易感性，但beta突变株例外。综上，膜锚定黏蛋白限制多种新冠病毒突变株的感染。
那体内的情况如何？作者使用新冠病毒小鼠适应株（MA10）感染三敲除小鼠模型（Muc1-/-/Muc4-/-/Muc16-/-），比较感染两天后肺部的病毒载量，发现高的病毒抗原和病毒RNA水平。因此，膜系留黏蛋白可以保护新冠病毒的在体感染。
黏蛋白调整新冠病毒入侵
下一个问题是，黏蛋白影响病毒生命周期的哪个阶段？由于四种黏蛋白均位于细胞表面，作者推测其可以减少病毒入侵。假病毒感染后的活细胞成像显示，CRISPR介导的黏蛋白及CD44过表达均可抑制病毒刺突蛋白介导的入侵。StcE处理MUC4和MUC1 GOF细胞会急剧增加病毒感染，即，去除mucin会增加细胞对病毒的易感性。
参考此前报道的黏蛋白通过空间位阻抑制流感病毒感染的例子【6】，作者推测膜锚定黏蛋白也阻碍新冠病毒结合细胞表面。于是作者通过病毒结合试验进行验证，发现当使用StcE消化黏蛋白后，细胞表面结合的病毒颗粒显著增多。此外，作者还使用荧光探针检测，发现MUC4 GOF细胞表面带有更加致密的糖被层。综上，内源性或上调表达的膜驻留黏蛋白限制新冠病毒入侵，尤其作用于初始的细胞结合阶段。
黏蛋白分为两类：膜锚定型（如MUC1或MUC4）与分泌型、可形成胶体的（如MUC5AC和MUC5B）。作者在GOF删除筛选中发现MUC5AC是一种前病毒因子。为验证其作用，作者构建MUC5AC和MUC5B GOF Calu-3细胞株并验证两种黏蛋白的表达，细胞系不表现任何保护效果，MUC5AC上调表达可增加对除epsilon外各种突变株的易感性。两类黏蛋白的不同效果使其在新冠病毒感染过程中的作用更加复杂。
黏蛋白调节多种呼吸道病毒的感染
最后，作者想确认膜锚定黏蛋白在其他呼吸道病毒中是否发挥类似作用？为此，作者首先测试MUC1和MUC4对另两种冠状病毒（MERS-CoV和带有非典S蛋白的蝙蝠冠状病毒KHU5假病毒）的作用，发现MUC4过表达对HKU5的影响较MUC1强烈，而在MERS-CoV中情况正好相反。使用StcE去除黏蛋白对两种病毒几乎没有影响。进一步地，作者发现去除黏蛋白可促进流感病毒PR8的感染，类似现象在人冠状病毒229E（HCoV-229E）及人副流感病毒PIV3已有报道。此外，作者还测试了分泌型黏蛋白MUC5AC和MUC5B对多种呼吸道病毒的影响，同样不显示保护效果，但MERS-CoV除外。总之，黏蛋白在多种呼吸道病毒感染中发挥重要作用，这种黏蛋白对呼吸道病毒的促进或限制作用也凸显出呼吸道病毒与肺黏蛋白间复杂的宿主-病原相互关系。
回顾全文，作者通过全基因组LOF和GOF筛选，在同时表达ACE2和TMPRSS2的肺上皮细胞中发现影响新冠病毒感染能力的宿主因子，包括促进病毒增殖及抗病毒的基因，并将这些基因在新冠肺炎病人中的富集情况进行联系分析。最后，作者系统分析膜驻留黏蛋白在新冠病毒入侵中的作用，并将其作用扩展到多种呼吸道病毒中。上述新冠病毒宿主因子功能谱的发现，将为靶向宿主的新治疗方案开发提供出发点。
https://doi.org/10.1038/s41588-022-01131-x
参考文献
1、Hofmann, M., et al. A multibasic cleavage site in the spike protein of SARS-CoV-2 is essential for infection of human lung cells.Mol. Cell78, 779–784.e5 (2020).
2、Goujon, C. et al. Bidirectional genome-wide CRISPR screens reveal host factors regulating SARS-CoV-2, MERS-CoV and seasonal HCoVs.Preprintat Res Sq.
3、Liao, M. et al. Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19.Nat. Med.26, 842–844 (2020).
4、Muus, C. et al. Single-cell meta-analysis of SARS-CoV-2 entry genes across tissues and demographics.Nat. Med.27, 546–559 (2021).
5、Su, M. et al. A mini-review on cell cycle regulation of coronavirus infection.Front. Vet. Sci.7, 586826 (2020).
6、McAuley, J. L. et al. Te cell surface mucin MUC1 limits the severity of infuenza A virus infection.Mucosal Immunol.10, 1581–1593 (2017).
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