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当2013年诺贝尔生理学或医学奖颁发给耶鲁大学细胞生物学系主任、生物医学教授詹姆斯·罗斯曼时，没人预测到他的发现“细胞的囊泡运输调控机制”会给未来10年的医学界带来如此多的惊喜。
詹姆斯·罗斯曼说：“我们正处在细胞生物学的黄金时代——我们的身体正在变成了药品的生产工厂，活细胞和外泌体正在成为治疗肿瘤等慢性疾病的主导药物。”
詹姆斯·罗斯曼获得了2013年度诺贝尔生理学或医学奖
外泌体介绍
外泌体（Exosome）是一种直径为30-200nm的纳米级脂质包裹体结构。
大多数细胞类型都分泌外泌体，包括免疫细胞(B细胞、T细胞、肥大细胞、树突细胞)、神经元细胞、上皮细胞、内皮细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞和间充质干细胞(MSCs)等等。几乎在健康和疾病状态下的所有体液中都检测到外泌体，包括诸如尿液、血液、血清、母乳、羊水、脑脊液、恶性腹水、唾液、胆汁和淋巴等等。（图1、2）
图1 典型的外泌体
人体内局部和远处细胞之间的强大通讯系统，具有多效性功能
图2 外泌体和干细胞的来源
几乎在所有体液中都检测到了外泌体，包括羊水、尿液、脑脊液、血液、血清、母乳、恶性腹水、唾液、胆汁等
外泌体是在1983年由Pan和Johnstone在研究绵羊网织红细胞成熟为红细胞的机制时首次发现的。研究人员发现了一种囊泡(他们后来将其命名为：“外泌体”)，最初外泌体被认为是细胞碎片垃圾，不过现在已经确定，外泌体由供体细胞释放到细胞外环境中，以执行多种生物学功能，包括细胞内通讯，母细胞和周围细胞之间的遗传物质和蛋白质交换的重要媒介(图1)。
外泌体的结构和组成取决于几个因素，包括供体细胞、微环境和生理条件，它通过细胞胞吐过程由内体小泡形成(图3)。
所有外泌体都由供体细胞的典型特征组成，并且携带包括蛋白质(四分蛋白、膜联蛋白、热休克蛋白等)、脂质(鞘糖脂、鞘磷脂、胆固醇)、遗传物质(DNA、tRNA、mRNA、miRNA、小的和长的非编码RNA(分别为sncRNA和lncRNA))和小分子代谢物(氨基酸、ATP、酰胺、糖等)
图3 外泌体的生物发生、分泌和摄取
细胞外环境由各种成分组成，包括蛋白质、脂质、小分子和许多代谢物，它们通过内吞作用进入细胞
越来越多的研究现实，这些神奇的小囊泡在帮助基因传递、疾病诊断、细胞内通讯、药物传递和生物标志物驱动的治疗方面拥有巨大潜力。
间充质干细胞外泌体
比外泌体临床应用更早的间充质干细胞疗法在疾病治疗中应用越来越普遍。
间充质干细胞除具备分化潜能，还大量分泌外泌体和多种生物分子，包括细胞因子、趋化因子和生长因子。
目前研究认为间充质干细胞在修复中的有益作用大部分归因于旁分泌信号，也就是外泌体的作用。特别在最新的几项研究中表明，由间充质干细胞分泌的外泌体可以替代间充质干细胞直接疗法，例如MSC衍生的外泌体(间充质干细胞外泌体)已经表现在伤口愈合和心肌梗塞的小鼠模型中可诱导自身修复，同样的效果发生在神经、呼吸、软骨、肾脏、心脏和肝脏疾病、骨修复和癌症等等领域(图4)。
图4 MSC衍生的外泌体方法学
MSCs分离，外泌体产生，外泌体分离，外泌体在再生医学中的治疗应用
与合成纳米颗粒、脂质体、单分子和细胞相比，间充质干细胞外泌体具有许多潜在的治疗优势，这源于其个性化的特征，例如更小的尺寸、更低的复杂性、没有细胞核(从而防止肿瘤转化)、增加的稳定性、更容易生产、更长的保存时间以及装载蛋白质、小分子、用于递送生物分子的RNA的潜力。
研究证实，在已知产生外泌体的细胞类型，间充质干细胞(MSC)是最高效多产的外泌体生产者。
下面我们回顾一下间充质干细胞外泌体在再生医学中的进展。
间充质干细胞外泌体的再生医学应用
间充质干细胞外泌体的研究近十年来发展迅猛，从下图论文发表数量曲线中就可以看出。
目前全球共有多项间充质干细胞外泌体临床研究，当前研究重心是确定最佳剂量、外泌体给药的适当时间窗口以及达到最大疗效且无不良反应的给药途径。
间充质干细胞外泌体的临床试验已经在阿尔茨海默病、肺部感染、急性呼吸窘迫综合征、新冠病毒感染、干眼症等疾病方面开始了1/2/3期研究。
以下，我们分别就外泌体在创伤、神经损伤和肝脏疾病等多种疾病中的表现进行介绍。
创伤愈合
皮肤的创伤愈合是一个复杂的过程，分为四个重叠的阶段：(1)止血，(2)发炎，(3)增生，(4)成熟/重塑(如图5)。
图5 伤口愈合的阶段
伤口愈合过程中涉及的主要事件是止血、炎症、增殖和重塑
尽管间充质干细胞的研究已经揭示自体和异体间充质干细胞在创伤愈合上的良好疗效，同时有研究表明当应用于慢性伤口时，来自MSCs培养基的有效性和再生能力类似于或大于MSCs。
因此，最近的研究分析了间充质干细胞外泌体作为慢性皮肤溃疡和增生性瘢痕的治疗方法的潜力，特别是生长因子和外泌体的微小RNA含量，以及外泌体在伤口愈合的不同阶段的调节中的可能作用。
外泌体可以靶向多种途径，包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT、ERK和STAT-3，这些途径通过下游靶标如肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子(NGF)和基质细胞衍生因子促进和加速伤口愈合。此外，Shabbir团队的一项研究证明了MSC-Exo给药诱导的VEGF显著增加，外泌体通过其对生长因子的作用，从而具备细胞增殖和分化调节特性以及高度的免疫调节、免疫抑制和血管生成活性。
外泌体被认为是炎症的重要调节物。特备是针对一些慢性炎症，如在糖尿病患者中发现的，其中较高水平的葡萄糖阻碍了正常的巨噬细胞极化(M1 → M2)，使这些患者易于发生慢性皮肤创伤。间充质干细胞外泌体可以促进巨噬细胞极化和减少细胞因子分泌以解决炎症阶段的问题。
外泌体已经显示出对增殖、胶原合成和血管生成的显著作用，甚至在慢性创伤和共病如糖尿病的状态下也是如此。几个微小RNA参与了这一步骤，包括miR-132、miR-126和miR-21。miR-132在增殖中发挥作用，因为它可以增加STAT-3和ERK途径的活性，从而促进角质细胞的生长。
同时更具创造性的方法正在开发中，例如将外泌体掺入凝胶中，然后应用于伤口。由于缓慢、稳定的递送速率，这种治疗方法已被证明比单次直接施用外泌体更有益，一些凝胶递送外泌体长达一周。这些支架提供了结构、水合作用，并增加了治疗选择的灵活性，因为水凝胶可用于从基本皮肤损伤到深层神经损伤的伤口。随着伤口愈合策略的不断发展，外泌体的广泛适用性和治疗优势将会大大拓展伤口愈合技术的前景和效率。
脑损伤
脑损伤，包括创伤性脑损伤(TBI)或中风，可导致长期残疾和预期寿命缩短，使其成为主要的健康和经济问题。这些创伤会对神经元组织和功能造成快速、急性和长期的损害。由于快速诊断的需要和通过血脑屏障(BBB)递送药物的困难，脑损伤的成功治疗受到限制。
间充质干细胞外泌体不仅能够通过静脉内或鼻内递送穿过血脑屏障，可以将许多遗传物质、神经营养因子和蛋白质传递到轴突，恢复微环境的稳态，调节轴突再生、促进神经形成和血管生成，使其成为复杂脑损伤治疗新办法。(图6）
图6 神经细胞通讯中外泌体功能的图示
TBI会对大脑造成即时创伤，其中神经元、神经胶质细胞和血管会拉伸或撕裂，从而诱导细胞凋亡并损害血脑屏障，随后是炎症反应，将神经胶质细胞招募到损伤部位，到达损伤处后，免疫细胞被激活，吞噬死亡和受损的细胞，并分泌促炎信号。在中度至重度损伤中，这种炎症反应不能正常解决，从而导致慢性炎症，慢性炎症的并发症可在损伤后持续数周至数年。
包括骨髓、脐带和脂肪组织在内的各种来源的间充质干细胞外泌体在调节TBI后的炎症反应方面显示出巨大的潜力。当间充质干细胞外泌体在脑损伤24小时内进行给药，可发现炎症反应减少，并通过促进神经发生和血管生成从而诱导恢复改善。这种效应部分归因于外泌体中包含的微小RNA，如miR-9、miR-124和miR-125b。
此外，外泌体可以调节TLR-4和巨噬细胞极化，从而促进脑损伤后的恢复。重要的是，脑震荡后给予间充质干细胞外泌体不仅可以帮助相关分子变化，进而改善脑损伤后常见的运动和认知缺陷。
另一种常见的脑损伤是中风，中风是全球发病率的主要原因，全世界每年估计有1500万中风。
中风有不同的类型，包括缺血性中风和出血性中风，中风会导致大脑缺氧、细胞死亡和过度炎症。间充质干细胞外泌体在中风治疗中作用同样潜力巨大。
缺血性卒中的主要治疗是输注组织型纤溶酶原激活剂(tPA)，与单独tPA治疗相比，tPA治疗中加入外泌体显著改善了中风后的功能结果。间充质干细胞外泌体治疗中风模可带来长期的神经保护、改善的神经发生和神经血管重塑，以及在运动功能、协调、感觉运动和空间学习方面增强的行为表现。伊斯法罕医科大学的最新临床研究（NCT03384433）正在探索携带miR-124的间充质干细胞外泌体对急性脑卒中的治疗作用。
这些研究表明，外泌体对神经损伤修复帮助巨大。
肝病
肝病包括诸如肝硬化和肝癌等疾病，每年全世界导致大约200万人死亡。
一些研究发现，用外泌体治疗有利于肝衰竭后的肝脏修复和再生，这种效应被认为是由于通过Wnt信号通路促进了血管生成。
在急性肝损伤中，肝细胞衍生的外泌体在体外刺激肝细胞增殖并在体内促进肝再生，潜在的机制被认为是外泌体介导的中性神经酰胺酶和鞘氨醇激酶2在再生位点的转移。
有研究间充质干细胞外泌体在治疗四氯化碳诱导肝损伤中的再生潜力，发现这些外泌体通过促进增殖和再生反应有效地减轻了四氯化碳诱导的肝损伤。
有研究来源于IPS的间充质基质细胞外泌体在肝脏缺血再灌注损伤中的潜在作用，显示出良好疗效，具有抑制的炎症反应、减弱的氧化应激反应和抑制的细胞凋亡。
充分表明外泌体是肝脏疾病的可行治疗选择。
心血管疾病
心血管疾病(CVD )例如心力衰竭和冠状动脉疾病，传统的CVD疗法主要包括移植和治疗，但治疗方法的临床疗效有限。因此，焦点已经转移到基于细胞的临床新方法。
最近的实验数据表明，通过基于细胞的疗法的自分泌和旁分泌作用的心肌保护功能可以通过外泌体发挥作用(图7) 。外泌体在生理和病理心血管过程中具有重要作用，包括调节血管生成、心肌细胞肥大、心脏纤维化、血压控制和抗凋亡作用已得到广泛认可。此外，外泌体由于其低免疫原性、栓塞风险小和没有基于细胞治疗的一些问题，并且可以以多种方式递送到心脏，包括工程外泌体、内源性外泌体、靶向外泌体或包含在贴片中的外泌体，应用将更为广泛。
心脏在心肌梗塞(MI)后经历广泛的心脏重塑，以恢复收缩功能。大量研究表明，心脏应激后，内源性外泌体可以改善心脏功能(图7) 。这表明外泌体在心血管疾病的治疗中具有有效的治疗作用。
图7 用于心脏修复治疗的干细胞来源的外泌体
基于外泌体的无细胞疗法对心血管疾病的治疗潜力适用于多种疾病，包括心肌梗死、动脉粥样硬化和扩张型心肌病。
在心肌梗塞中，越来越多的证据表明，施用外泌体可以增强心脏修复。例如，一项研究表明，间充质干细胞外泌体通过下调CD68的表达来改善心脏功能。从miR-146a修饰的脂肪来源干细胞(ADSCExos)获得的外泌体已被证明可通过抑制促炎细胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的释放来抑制局部炎症反应，从而减轻急性心肌梗死诱导的心肌损伤。同一份报告进一步证明，ADSCExos通过早期生长反应因子1下调抑制心肌细胞凋亡来改善心脏功能。黄等发现，来自阿托伐他汀(ATV)预处理的MSC的外泌体(MSCATV-Exos)通过降低IL-6和TNF-α水平、促进血管生成和防止心肌梗死后细胞凋亡来改善心脏功能障碍和减少梗死面积。脂肪来源的基质细胞(ADSC)来源的含有miR-93-5p的外泌体也有利于通过提供对抗自噬、凋亡和炎症的保护来治疗心肌梗死。另外，在心肌梗死的小鼠模型中，缺氧衍生的外体miR125b-5p通过抑制促凋亡基因的表达，发挥心脏保护功能并增强心脏修复p53和BAK1，从而抑制心肌细胞凋亡。
在动脉粥样硬化的治疗中也体现了外泌体的治疗前景，间充质干细胞外泌体通过上调miR-let7诱导M1→M2巨噬细胞极化，在阻止动脉粥样硬化进展中发挥保护作用，间充质干细胞外泌体对扩张型心肌病也有效，外泌体可通过阻碍炎性细胞因子的表达和增强抗炎M2巨噬细胞的产生来减少心室扩张.
在慢性心力衰竭中，一项研究表明，外泌体可显著提高胞外miR-146水平从而抑制炎症反应，进而改善心衰症状。
以上研究表明间充质干细胞外泌体有望在各类心血管疾病的治疗中发挥作用。
骨修复
骨健康是一个日益上升的问题和公共健康问题。
在骨重建和骨折愈合过程中，破骨细胞重吸收旧的或受损的骨，而新骨由成骨细胞合成，愈合级联开始，导致炎症细胞的募集、新血管的形成和骨折部位血肿的形成，这些骨折的治疗包括自体和异体移植，然而，这些手术需要较长的恢复时间，因此增加了并发症的可能性。
近年来，基于组织工程的生物材料和细胞疗法已成为骨折治疗的主要新方式。研究已经确定，基于细胞的治疗的生物效应主要是通过外泌体实现的，因此，骨修复的外泌体调节已经成为一种可行的治疗策略。
许多研究证实了外泌体在骨重建和骨折愈合中的潜在调节作用。
各种来源的外泌体已被证明对骨修复有益。其中最主要的是间充质干细胞外泌体，它在通过微小RNA调节诱导骨分化活性中发挥有希望的作用，从脂肪组织MSCs获得的外泌体，经TNF-α预处理，通过调节Wnt途径促进原代成骨细胞分化。
来源于矿化成骨细胞的外泌体通过直接调节成骨细胞增殖和经由介导miRNA谱刺激成骨细胞前体分化为成熟成骨细胞来促进新骨生长，这连续激活骨形成和基质矿化的下游信号通路。从人类IPS衍生的MSCs中分离的外泌体通过激活PI3K/AKT途径有效地增强了β-TCP的骨诱导性,间充质干细胞外泌体通过增强早期细胞浸润和增殖，诱导滑膜巨噬细胞极化，并表现出抗凋亡活性来促进软骨再生。
在大鼠骨软骨缺损模型中，人胚胎来源间充质干细胞外泌体的关节内给药改善了组织学评分和外观；经过12周的治疗，软骨和软骨下骨完全恢复。间充质干细胞外泌体通过有效抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的水平来减少炎症性骨折愈合的延迟，而增加抗炎因子TGF-β的水平。
血管形成是骨形成中的重要事件，因为它改善了对新骨形成至关重要的氧和营养成分的扩散。各种报道表明，外泌体参与血管内皮细胞(ECs)的活动，包括迁移、增殖和成管。来源于内皮祖细胞的外泌体通过激活人脐静脉内皮细胞和人哺乳动物内皮细胞中的eNOS和PI3K/AKT途径，在体外和体内均能诱导血管样结构的形成。
骨病修复的主要作用机制是通过微小RNA的活性和调节，其中许多已在外泌体中被证明存在。例如，研究人员已经确定miR-199b参与了Runx 2的调节，Runx 2是成骨细胞和骨细胞分化的主要转录因子，同时富含miR-21的外泌体具有抗凋亡特性，并可通过调节小母细胞对抗decapentaplec 7(Smad 7)和调节PI3K/β-连环蛋白通路来促进成骨细胞的形成。
因此，富含特定因子(如miRNA、细胞因子或生长因子)的外泌体在骨修复中可以发挥重要作用，上述的积极结果为基于外泌体的骨折愈合疗法提供了新的证据。
新冠肺炎
2019年底，新冠肺炎爆发并形成全球疫情。
在新冠肺炎，SARS CoV-2病毒感染肺部后，与其他免疫细胞一起引发细胞因子分泌的免疫反应，导致称为细胞因子风暴的高度炎症状态。大量研究表明，间充质干细胞可以与免疫细胞如B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞相互作用并调节其功能。在新冠肺炎，新型冠状病毒通过与血管紧张素转换酶2 (ACE2)结合进入体内，血管紧张素转换酶2是一种位于许多细胞类型(包括肺部细胞)细胞膜上的酶。间充质干细胞不含任何ACE2受体，使它们对新型冠状病毒免疫。
有趣的是，一些研究已经证明来源于间充质干细胞的外泌体抑制细胞因子的释放并降低炎症水平。除此之外，Dinh等人研究表明外泌体可以帮助肺纤维化条件下的肺再生。
因此，外泌体有可能与其他疗法结合用于治疗重症新冠肺炎患者(图8)。
中国瑞金医院等机构（见下表)）均注册了外泌体临床研究，旨在探索外泌体治疗重症新冠肺炎。发表在《Stem Cells and Development》上的一文指出，间充质干细胞来源外泌体在治疗重症新冠肺炎患者成效显著，康复率高达71%。外泌体具有安全性、恢复氧合、下调细胞炎症因子和重建免疫系统功能等优点，是一种很有前途的新冠肺炎治疗候选药物。
图8 细胞因子风暴在新型冠状病毒感染中的作用
以及间充质干细胞和间充质干细胞外泌体的可能治疗作用的示意图
外泌体治疗新冠肺炎治疗临床试验列表
结论与展望
除了上述领域外，间充质干细胞外泌体还在肿瘤、GVHD、1型糖尿病、肾损伤、抗衰美容方面具备广阔的应用前景。
以下我们简要的总结下间充质干细胞外泌体临床应用的优势：
（1）间充质干细胞来源外泌体具备组织损伤修复和免疫调控功能；
（2）外泌体相较于间充质干细胞对冻融损伤适应性更强，在体内稳定性高；
（3）外泌体不会自我复制，无胚胎干细胞潜在的成瘤风险；
（4）外泌体相比于间充质干细胞体积更小且膜表面组织抗原低/无表达，不易引起免疫应答；
（5）外泌体可穿透血脑屏障（BBB）。
现在的研究认为外泌体应用有可能成为基于干细胞的再生疗法的替代方式，成为再生医学的一支主力军。
但挑战依然存在，譬如尽管许多蛋白质、RNA、脂质和代谢酶已在外泌体中被鉴定，但对它们的功能和分类机制我们目前知之甚少，外泌体在体内和病理状态下的确切分子机制和作用仍然需要进一步研究，外泌体的产生、细胞摄取和运输领域的研究需要加强。另外涉及在临床中使用外泌体还有一些瓶颈，包括分离、纯化、优化、标准化、质量控制等等。
总的来说，在再生医学和组织工程中干细胞外泌体的潜力是非常有前途的。
参考资料：
Hade, M.D.; Suire, C.N.; Suo, Z. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes: Applications in Regenerative Medicine. Cells2021, 10, 1959.
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