影响新冠病毒核酸检测灵敏度的技术环节
——不可“混检”，但正常检测环节中核酸的稀释或折损也不容忽视
杨瑞锋
北京大学人民医院，北京大学肝病研究所；丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室；国家感染性疾病临床医学研究中心分中心
近期国内数家新冠病毒核酸检测实验室被曝存在违规的“混检”操作，将n个咽拭子样本各取1/n的体积，混在一起进行提取和逆转录（RT）-PCR。此般“骚操作”可节省试剂成本，降低劳动强度，但会导致检测灵敏度降低，增加“假阴性”风险，影响防疫，因此，实验室管理者也受到了处罚。
“混检”属违规操作，实属不该，但另一方面，新冠病毒核酸检测又有其特殊性。它并非像HBV、HCV和HIV等血源性病毒那样“现成”、均匀地分布于血清或血浆等液态样本中，而需通过拭子（主要为鼻咽或口咽拭子）沾取患处，将其浸没于保存液，让沾染于拭子上的病毒落于其中，接着，通过吸取一部分保存液来提取核酸，之后再吸取一部分核酸模板液进入RT-PCR体系。实际上，诸多环节都伴随核酸的稀释或折损，见下图（图中数据皆为举例说明）。
假设咽拭子沾取到了1000拷贝新冠病毒RNA，最后能进入RT-PCR体系的病毒可能只剩几个拷贝（见上图），一通操作猛如虎，却伴随核酸惊人的损耗（>99%）。这也就解释了为何个别患者感染新冠病毒，却十有八九测到“阴性”结果；同时也提示，新冠病毒核酸检测的环节更多，更难实现检测的标准化，结果的不确定度更大，所以往往需要多次检测。
我们可用国际主流的CoabsTaqman HCV RNA高敏检测平台作为对比——取500μL血清或血浆，提纯得到HCVRNA模板65μL，取50μL加入RT-PCR体系，总反应体积为100μL。可见，除了提取过程中损耗的一部分HCVRNA，大部分RNA都可投入RT-PCR，可实现高敏核酸定量检测，同时，大体积的操作，也更有利于保证结果的可重复性。
针对新冠病毒核酸检测的每一环节，笔者给出几点有助于提升检测灵敏度的建议，尤其可考虑应用于新冠高风险人群的筛查：
1.减少病毒保存液体积，提高病毒浓度。当前病毒保存液体积通常为3mL，这是单人单检的体积（10或20“混采”的保存液体积更大），毫无疑问，过量的保存液会稀释病毒，实际上，有效淹没咽拭子即可，管子也不必做得那么粗壮；保存液体积压缩一半，即可提前1个循环阈值（Ct）值；若体积压缩到1/10，更可提前3.32个Ct值。不过，保存液体积减少，可能会变得粘稠，提取时，需保证蛋白被充分消化和裂解，而不至于影响RNA的提取。
2.震荡以使咽拭子上的病毒充分脱落于保存液中。静滞的咽拭子不利于病毒脱落，病毒也不易均匀分布在保存液中。若采用自动化吸样装备，枪头只吸取表层保存液，更易漏取病毒。然而，在实践中我们发现，在样本量大的时候，这种操作细节其实非常容易“被迫”省略。
3.增加核酸提取的上样量。当前提取试剂取约200μL保存液用于核酸提取，而国际主流的提取血清或血浆HBV/HCV/HIV核酸的上样量可达400μL甚至更多。若将上样量增加至400μL，即可提前1个Ct值。
4.提高核酸得率。磁珠法提取核酸的得率不及过柱法。不过，为了便于自动化，大都采用磁珠法提取核酸。内部对照（IC），特别是外源性IC，可用于监控核酸提取效率，但目前判断新冠病毒核酸提取效率的指标往往是IC有扩增曲线即可，很少要求Ct值或Ct均值须落入某一狭窄的区间以精确监控提取效率。
5.减少洗脱液体积，提高模板RNA浓度。例如，若能将洗脱液从100μL缩至50μL，可提前1个Ct值。
6.增加投入RT-PCR体系的RNA模板液比例。例如，若将RNA模板从5μL增加至10μL而体系总体积不变，可提前1个Ct值；若能增加至20μL，则可提前2个Ct值，以此类推。当然，前提是提纯技术要过关，RNA要够纯，否则加大模板体积，会带入各种阻碍RT-PCR反应的物质，适得其反。
7.增大RT-PCR反应体系。当前的新冠核酸RP-PCR体系总体积多为25μL，增大体系有利于投入更多的模板RNA参与反应，统计学上讲，也有利于提高痕量核酸被扩增的概率，但试剂成本也相应会增加。
医学检验的落脚点往往是社会经济学，需要在追求灵敏度和成本效益之间做到平衡。即使如此，我们仍应意识到存在影响灵敏度的技术环节，提示我们应专注技术，保持匠心，争取实现新冠病毒和HBV、HCV和HIV一样的“高敏”、标准化核酸检测，为抗击疫情提供更有力的技术保障。
感谢滦南县医院检验科朱学良对本文提出建议。
编辑：笪文武 审校：陈雪礼