撰文 | 阿呜
基因的点突变或者重组会导致肿瘤携带有异常的转录因子，其中由重组基因产生的具有促癌特性的融合转录因子又被称为肿瘤嵌合转录因子（oncogenic chimeric transcription factor,OCTF）且在肉瘤中尤其常见【1,2】。尤文肉瘤（Ewing sarcoma,EwS）是一类在青少年时期发病且具有高度侵袭性的肉瘤，通常携带有OCTFs。尤文肉瘤的OCTF由RNA结合蛋白PET家族和转录因子ETS家族融合产生，其中85%的临床病例中携带EWSR1 (EWS) 和FLI1融合产生的OCTF，即EWS-FLI1【3,4】。与野生型ETS转录因子相比，EWS-FLI1肿瘤嵌合转录因子能够通过结合含有GGAA微卫星序列的肿瘤特异性增强子来激活相关基因的表达，具有功能获得型活性【3,4】。
2022年5月11日，法国居里研究所Olivier Delattre和Joshua Waterfall课题组合作在Molecular Cell上发表题为Oncogenic chimeric transcription factors drive tumor-specific transcription, processing, and translation of silent genomic regions的研究文章，研究发现了肿瘤嵌合转录因子OCTF能够在基因沉默区域诱导肿瘤特异性新基因的转录、翻译和蛋白表达，为肿瘤的治疗提供了新的潜在靶点。
研究人员首先采用PacBio全读长转录组测序技术（long-read IsoSeq）对尤文肉瘤A673细胞系进行了长读长测序。通过对测序数据与已注释基因对比分析发现了80个新型的转录本，这80个转录本位于非注释基因的区域（即基因沉默区域）因而在常规测序中在组装过程中就会被剔除掉。研究人员猜测这些新型转录本可能是OCTF的靶点。通过设计特异性针对EWS-FLI1的shRNA，研究人员对其中4个新转录本进行了验证，结果显示敲低EWS-FLI1确实能够降低新转录本的表达。进一步的，研究人员通过染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）发现敲低EWS-FLI1能够降低其在这些转录本起始位置上的结合信号，且结合位点含有经典的GGAA微卫星序列。由此证明了EWS-FLI1能够调控这些新型转录本的表达。接着，研究人员分析了公共数据库（GTEx、HPA、TCGA）以及132例尤文肉瘤临床样品的RNA-seq数据，发现了经过验证的4个新转录本在大多数尤文肉瘤中有很高的表达，而在正常组织和其他类型的肿瘤中基本不表达。研究人员由此得出结论EWS-FLI1能够结合位于基因沉默区域的GGAA微卫星序列从而诱导尤文肉瘤特异性的新型转录本的表达，并称这些新型转录本为肿瘤特异性基因，即neogenes（NGs）。
研究人员继续探讨了尤文肉瘤中是否存在更多的NGs。鉴于长读长测序对临床样品测序的技术限制，研究人员设计了一套新的针对尤文肉瘤特异性肿瘤转录本的鉴定方法，即首先将常规短读长RNA-seq的数据与GENCODE参考转录组进行比对，找出无法匹配的新转录本，接着寻找只在尤文肉瘤中表达而不在正常组织和其他类型肿瘤中表达的新转录本。通过分析，研究人员鉴定出了61个尤文肉瘤特异性肿瘤转录本，除去剪切生成的不同转录本，最终定位找到26个NGs，即Ew-NGs。
接着，为了探究OCTF EWS-FLI1是如何调控这26个Ew-NGs的，研究人员先是在9个尤文肉瘤细胞系中敲低了EWS-FLI1，结果显示敲低EWS-FLI1降低了大多数Ew-NGs的转录表达。为了进一步验证这些Ew-NGs是在尤文肉瘤中特异性表达的，研究人员对尤文肉瘤肿瘤样品和结缔组织增生性小圆细胞肿瘤（desmoplastic small round cell tumor，DSRCT）样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），结果显示这些Ew-NGs只在尤文肉瘤细胞中表达，而不在DSRCT细胞和肿瘤微环境中的其他细胞中表达。ChIP-seq结果显示OCTF EWS-FLI1能够结合这些Ew-NGs转录起始位点GGAA微卫星序列。通过CRISPRi敲除微卫星序列发现可以降低这些NGs的转录本水平。利用HiChIP蛋白质-基因组空间连接技术，研究人员发现 10个Ew-NGs带有增强子-启动子环的存在，CRISPRi敲除增强子验证了其对Ew-NGs的转录调控。以上的实验结果证明了OCTF EWS-FLI1通过结合启动子或增强子的GGAA微卫星序列转录调控Ew-NGs。
那么这些Ew-NGs能够表达生成特异性的多肽或者蛋白吗？研究人员首先通过RNA 荧光原位杂交（FISH）实验证明了尤文肉瘤细胞系中NGs的转录本的存在，敲低EWS-FLI1也显著影响了FISH的信号。接着，通过核糖体印记测序（Ribo-seq），研究人员发现Ew-NGs的RNA上有较高的多聚核糖体翻译以及蛋白翻译对应的开放阅读框。进一步的，研究人员通过质谱检测对这些特异性肽段进行了验证。此外，shRNA和CRISPRi敲低EWS-FLI1后也降低了这些特异性多肽的表达。以上结果证明了EWS-FLI1驱动的Ew-NGs具有翻译功能的开放阅读框并编码全新的肿瘤特异性多肽和蛋白。
最后，研究人员探讨了在其他肿瘤中是否存在相似的现象。首先，研究人员分析了另一种肉瘤，即DSRCT。DSRCT携带OCTF EWS-WT1融合蛋白，采用相同的分析方法，研究人员鉴定出了105个DSRCT特异性的肿瘤转录本和对应的37个DSRCT-NGs。通过多种实验验证了DSRCT-NGs是受到了EWS-WT1的调控。接着，研究人员对更多携带有OCTF的肿瘤进行了分析，包括14种肉瘤和1种中线癌和1种肾细胞癌。研究人员一共发现了398种肿瘤特异性的NGs及对应的807个肿瘤特异性转录本，证明了NGs在肿瘤中是普遍存在的。
图1. 肿瘤嵌合转录因子（OCTF）驱动肿瘤特异性新基因的表达示意图
总的来说，该研究论文通过长读长测序技术发现了一类受肿瘤嵌合转录因子OCTF驱动的肿瘤特异性新基因NGs。由于这类NGs通常位于基因沉默区域因而在常规的测序中往往会被当作错误序列而删掉，该研究重新发现了这类NGs且证明了这些受OCTF驱动的NGs具有转录、翻译和编码蛋白的功能，为今后研究OCTF驱动的肿瘤提供了新思路和新的潜在治疗靶点。
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.04.019
制版人：十一
参考文献
1. Patel, M., et al., Tumor-specific retargeting of an oncogenic transcription factor chimera results in dysregulation of chromatin and transcription.Genome Res, 2012. 22(2): p. 259-70.
2. Perry, J.A., B.K.A. Seong, and K. Stegmaier, Biology and Therapy of Dominant Fusion Oncoproteins Involving Transcription Factor and Chromatin Regulators in Sarcomas.Annual Review of Cancer Biology, 2019. 3(1): p. 299-321.
3. Riggi, N., et al., EWS-FLI1 utilizes divergent chromatin remodeling mechanisms to directly activate or repress enhancer elements in Ewing sarcoma.Cancer Cell, 2014. 26(5): p. 668-681.
4. Riggi, N., M.L. Suva, and I. Stamenkovic, Ewing's Sarcoma.N Engl J Med, 2021. 384(2): p. 154-164.
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