撰文 | 言笑
每次服用药物都会好奇地想“这药吃下去后，都去哪儿了呢？”所有人应该都想知道答案吧。不过，这却是一个长期困扰科学界的未解之谜。想要追踪小分子药物在体内的分布情况，尤其是在复杂的脑部，就需要在单细胞分辨率上实现小分子药物的成像，看清它们与每个细胞结合的情况。目前，基于成像的方法，如正电子发射断层扫描（positron emission tomography,PET），被广泛用于分析体内小分子分布，但缺乏足够的分辨率来区分细胞水平的药物结合状态【1】。荧光显微镜彻底改变了内源性生物分子（如蛋白质和核酸）的高分辨率原位成像，但外源性小分子更难成像，因为附加荧光标记会改变母化合物的大小和化学性质，进而可能会改变药物性质【2】。那么什么样的荧光标签修饰方式，可以在不影响药物性质的前提下清晰成像？解答这些问题，对于理解药物作用机制、推进未来的药物研发有着重要意义。
2022年4月27日，来自美国斯克里普斯研究所的Li Ye（叶立）团队在Cell杂志在线发表了题为In situ identification of cellular drug targets in mammalian tissue的文章。研究人员首次在生物体内实现了单细胞分辨率的小分子药物成像，并将该方法命名为透明辅助组织点击化学（Clearing-Assisted Tissue Click Chemistry，简称CATCH）：它将荧光标签附着在药物分子上，并使用化学技术来改善荧光信号，进而可在亚细胞分辨率对靶药物分子进行特异性和稳健的原位荧光成像，并能够鉴定靶细胞类型。CATCH为药物机制的理解和药物研发提供了一个有价值的平台。
在该研究中，作者采用了近年来备受青睐的“点击化学”（Click chemistry），它是由诺奖得主巴里夏普莱斯（Barry Sharpless）教授在2001年引入的一个合成概念，强调以碳-杂原子键（C-X-C）合成为基础的组合化学新方法，并借助这些反应来简单高效地获得分子多样性，是目前最有用和吸引人的合成理念之一。点击化学反应主要有4 种类型：环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应。其中被文献广泛应用的是：铜催化叠氮与炔烃环加成反应（Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition, CuAAC）。
为了引入荧光基团，作者首先在药物上修饰末端炔基（不影响小分子药物的活性与选择性），当小分子药物到达“目的地”，CuAAC开始发挥作用——炔基与荧光标签分子上的叠氮化物加成、形成一个环状分子，从而引入荧光标签，最后进行荧光成像分析。接下来作者使用了具体的药物来评估上述实验方案的有效性。经过炔基修饰的脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase, FAAH）抑制剂PF7845-yne可以与FAAH形成稳定的共价键【3】，因此作者尝试在小鼠脑切片中直接成像观察FAAH结合PF7854-yne的情况。然而，成像信噪比（Signal-to-noise ratio, SNR）极差，无法获得有效信号。作者推测，组织的复杂组成，特别是致密的脂质膜，可能会阻碍CuAAC反应，因此作者在实验方案中加入了组织透明技术，在保持原有细胞形态的同时去除脂质。与预期的一致，SNR得到了显著改善，但对照组中依旧存在背景信号，作者随后针对CuAAC反应进行了一系列优化，最终实现了动物组织内高效专一的药物荧光标记（图1）。作者将这项技术命名为透明辅助组织点击化学（Clearing-Assisted Tissue Click Chemistry，CATCH）。
图1. CATCH流程示意图
接下来，作者通过研究另外两种共价药物靶标组合评估了CATCH更广泛的效用：结构上不同的FAAH抑制剂BIA-10-2474【4】和单胺氧化酶（monoamine oxidase, MAO）抑制剂pargyline【5】（图2A）。通过CATCH，作者发现不同药物分子在小鼠脑区的分布情况不同：PF7854-yne和BIA-10-2474主要分布在neocortex, thalamus和hippocampus（图2B）；相反，pargyline-yne主要富集在hypothalamus，pons和lateral ventricles。更高分辨率的成像还可以显示这些分子主要靶向的细胞类型：FAAH抑制剂主要靶向新皮层和海马体中的神经元，相反，pargyline-yne主要与整个大脑中的血管结合，同时与下丘脑和脑桥中某些特异性的神经元结合。
图2.（A）PF7845-yne, BIA10-2474-yne和pargyline-yne的化学结构；（B）FAAH的表达及PF7845-yne、BIA10-2474-yne在大脑中的分布。
最后，作者通过Competitive CATCH和Direct CATCH揭示不同剂量的药物具有的分布差异：如图3所示，Competitive CATCH中0.02 mg/kg剂量下，Cortex（S1）中的FAAH被完全抑制，但Hippocampus（DG和CA1）中的FAAH并没有被完全抑制。作者用凝集素染色大脑切片以标记脉管系统结构，发现具有低探针强度的区域与侵入血管有关；相反，在Direct CATCH中可以观察到镜像强度模式，其中较高的探针强度靠近血管系统。这些数据表明，在药物未达到饱和剂量时，离血管近的区域有更高的药物结合，这将有效地产生药物梯度。
图3. Competitive CATCH: 在低剂量下，母体药物不能完全阻断靶标，为随后的炔烃药物结合留出空间；在高剂量下，母体药物使靶标饱和，从而消除炔烃药物结合; Direct CATCH: 更高的目标饱和度与更高的 CATCH 标记强度相关联。
总的来说，研究人员开发了一种全新的技术CATCH来实现单细胞分辨率的小分子药物成像，这项技术以前所未有的细胞和分子分辨率将药物作用可视化，为理解小分子药物功效与潜在的副作用机制带来了新的机遇。同时，研究人员也指出该研究还具有一定的局限性：（1）CATCH现阶段其主要应用于“共价抑制剂”，即药物基团能与靶点形成共价键，针对“非共价抑制剂”，还有待进一步探究；（2）CATCH目前还不能直接应用于全脑或全身成像，作者正在试图逐步扩大成像体积，最终希望能在完整小鼠内进行单细胞分辨率的药物成像。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.040
制版人：十一
参考文献
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