CRISPR/RfxCas13d (CasRx) 编辑系统可以特异性和精确地切割单链 RNA，通过下调相关基因表达来治疗各种疾病是一种很有前途的治疗方法。
2022年3月14日，复旦大学舒易来，李耕林及中国农业大学胡晓湘共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy （IF=18）在线发表题为“Preventing autosomal-dominant hearing loss in Bth mice with CRISPR/CasRx-based RNA editing”的研究论文，该研究在Beethoven (Bth) 小鼠上测试了这种 RNA 编辑方法，这是一种人类 DFNA36 的动物模型，由于 Tmc1 中的点突变。该研究首先在细胞培养物中筛选了 30 种 sgRNA，发现带有 sgRNA3 的 CasRx 使 Tmc1Bth 转录物减少了 90.8%，Tmc1 野生型转录物 (Tmc1+ ) 减少了 44.3%。然后，该研究将新开发的基于 AAV 载体 (AAV-PHP.eB) 的 CasRx 注入新生 Bth 小鼠的内耳，发现 Tmc1Bth 在 2 周内减少了 70.2%，在整个转录组中几乎没有脱靶效应。
始终如一地，该研究发现毛细胞存活率提高，毛束退化得以挽救，机电转导电流降低。重要的是，以 ABR 和 DPOAE 阈值衡量的听力表现在 8 周内所有年龄段的小鼠都有显著改善。因此，该研究已经验证了基于 CRISPR/CasRx 的 RNA 编辑策略在治疗常染色体显性遗传性听力损失中的作用，为其在听力及其他许多其他遗传性疾病中的进一步应用铺平了道路。
另外，2022年2月23日，复旦大学舒易来，李华伟，中国科学院上海神经科学研究所杨辉及中国农业科学院左二伟合作在Cell Research 在线发表题为“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究论文，该研究基于同源介导的末端连接 (HMEJ) 的策略，修复了小鼠（Klhl18lowf 小鼠）常染色体隐性听力损失障碍。该研究的概念验证结果显示了进一步开发基于 HMEJ 的策略来修复导致遗传性听力损失以及其他人类遗传疾病的点突变的希望。
根据世界卫生组织 (WHO) 的数据，听力损失是最常见的感觉缺陷之一，全球约有 5% 的人口患有致残性听力损失，其中 3400 万是儿童。在儿童中，听力损失会影响认知、语言和心理社会发展。几乎一半的耳聋病例是由遗传因素引起的，在不同类型的遗传性听力损失中，20-25% 的非综合征性听力损失 (NSHL) 病例为常染色体显性遗传。
迄今为止，已证实 100 多个基因与 NSHL 相关 (https://hereditaryhearingloss.org/)，并且在老龄化人群中，常染色体显性遗传的患病率增加，而常染色体隐性遗传的患病率降低。例如，TMC1 是第六大最常见的遗传性耳聋基因，TMC1 的突变导致显性和隐性 NSHL。它的蛋白质产物 TMC1 被认为具有十个跨膜结构域，并且与 TMC2 一起形成了通道复合体的孔，这是听觉和前庭毛细胞中声音的机械电转导所必需的。人类TMC1点突变（c.1253T > A；p.M418K），与Bth小鼠Tmc1突变（c.1235T > A；p.M412K）相同，颠换T > A位于第13外显子Tmc1 序列。这种突变导致 DFNA36 听力损失，因此 Bth 小鼠将成为 NSHL 研究的合适模型。
目前，临床上很少有治疗方法可以减缓或逆转遗传性耳聋。随着对与听力损失相关的遗传的了解越来越多，人们对听力损失基因疗法的兴趣也越来越大。基因替代首先被用于成功恢复小鼠的听力。随后的研究也证实了基因替代在治疗遗传性听力损失方面的有效性，但基因替代不能根据细胞的需要精确调节基因表达。基因编辑技术作为一种新的基因治疗方法已应用于遗传性听力损失的治疗，并将CRISPR/Cas系统导入内耳成功改善了Bth模型小鼠的听力损失。此外，将胞嘧啶碱基编辑器包装到双 AAV 中恢复了 Baringo 小鼠的基因功能，这些小鼠在 Tmc1 基因中携带隐性功能丧失点突变，这表明体内碱基编辑可以部分和短暂地挽救听觉功能。
筛选用于靶向 Tmc1Bth 转录物的有效性和特异性 sgRNA（图源自Signal Transduction and Targeted Therapy ）
然而，基因组编辑可能会在与靶向序列相似的 DNA 序列中诱导脱靶突变，这限制了这种技术的实用性，特别是在治疗和临床应用中。然而，在 RNA 水平上的基因疗法只改变了目标 RNA 的表达，而不影响 DNA。近年来，RNA调控已被用于治疗小鼠听力损失。例如，在小鼠模型中应用反义寡核苷酸来挽救 Ush1c (c.216G > A) 的内耳突变；RNA 干扰和人工 microRNA 降低了 RNA 表达并防止听力损失。然而，这些传统的 RNA 调节工具引起的广泛的脱靶转录沉默一直是一个令人担忧的问题。
CRISPR/Cas13作为一种新型的RNA干扰工具，是最初用于减轻细菌病毒感染的2类VI型CRISPR/Cas RNA内切酶，比传统的RNA干扰工具具有更高的特异性。已鉴定出 Cas13 蛋白家族的四个成员，包括 Cas13a（以前称为 C2c2）、Cas13b、Cas13c 和 Cas13d。据报道，PspCas13b 和 CasRx 比其他 Cas13 具有更高的活性和特异性。
作为目前最紧凑的 Cas13 酶，CasRx 可以很容易地封装到 AAV 中，这使得 CRISPR/CasRx 系统在体内传递变得很方便。CasRx 已被用作肝脏和咽部疾病小鼠模型的治疗工具，与其他基因编辑系统相比，RNA 编辑系统可以为基因沉默提供更安全的方法，而不会永久改变基因组。此外，protospacer flanking sequence (PFS) 对于大多数 Cas13 是必需的，限制了 sgRNA 序列的选择，特别是对于特定的致病点突变。相比之下，CasRx 系统没有 PFS 限制，因此可以设计和筛选更广泛的 gRNA。
仍然缺乏使用 CRISPR/Cas13 RNA 编辑系统进行遗传性耳聋治疗的研究。为了探索 CRISPR/Cas13 的潜在治疗效果，该研究筛选了 30 个在所有可能位置匹配单点突变的 sgRNA，以靶向 Tmc1 的致病等位基因，该研究比较了 PspCas13b 和 CasRx 系统之间的编辑特异性和效率，以选择一个 最佳 sgRNA。
该研究使用新开发的 AAV 载体 AAV-PHP.eB，对内耳毛细胞具有高转导效率，将 CasRx 和 sgRNA 递送至出生小鼠耳蜗，并成功下调 Tmc1Bth 转录物的表达。Tmc1Bth/Tmc1+ mRNA 表达比率的变化，防止了进行性听力损失，改善了毛细胞和静纤毛束的形态，没有可检测到的脱靶效应。这些结果表明，CasRx RNA 编辑是一种治疗遗传性耳聋的潜在临床方法。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41392-022-00893-4