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摘要
Abstract
脑恶性肿瘤是一系列原发性和转移性癌症，包括源自不同颅外肿瘤的低级别和高级别神经胶质瘤和脑转移瘤 (BrM)。目前对脑肿瘤微环境 (TME) 的了解仍然有限，并且 原发性和转移性是否塑造不同地TME不得而知 。因此，通过流式细胞术、RNA测序、蛋白质芯片、细胞培养和空间组织表征全面分析了大脑TME。研究表明，免疫细胞呈疾病特异性富集，在组织驻留的小胶质细胞、浸润的单核细胞衍生的巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞的比例丰度方面存在显著差异。这一全面的免疫领域资源为克服支持肿瘤的TME特性，并为利用TME对抗癌症的可能策略提供了见解。
免疫细胞组成
Immune cells
用免疫荧光(IF)分析整个组织切片，和非肿瘤脑组织的流式细胞术 (FCM) 分析、IDH-mut低级别和IDH-wt高级别胶质瘤，以及源自不同原发性肿瘤的BrM，包括乳腺癌、肺癌和黑色素瘤（图1A和1B）。结果表明，白细胞丰度约为20-40%。CD45+细胞分为髓系和淋巴系，与非肿瘤组织相比，IDH-mut和IDH-wt胶质瘤中的髓系细胞显著增加，IDH-wt胶质瘤和BrM中的淋巴细胞显著增加。然后，通过CD49表达区分样本中MG(microglia，CD45+, P2RY12+/CD68+, CD49D−)和MDM(monocyte-derived macrophage，CD45+, P2RY12+/CD68+, CD49D+)（图1C）。T-MDM（tumor-associated MDM）在IDH-mut低级胶质瘤中增加了MG核心基因组信号，而T-MG（tumor-associated MG）在BrM中获得MDM特征，表明这些细胞存在组织依赖性转录编程。
使用聚类分析肿瘤内免疫细胞群的分布情况，以确定细胞丰度的模式（图 1D）。三个主要集群：（1）非肿瘤样本和 IDH mut 胶质瘤，其特征是MG占优势，其他免疫细胞数量较少；（2）IDH-wt神经胶质瘤和几种BrM，伴有MDM和一定程度的中性粒细胞浸润肿瘤，但大部分不包括淋巴细胞；（3）BrM和少量的IDH-wt神经胶质瘤，具有最多样化的免疫细胞类型，T细胞和中性粒细胞大量浸润其中。某些肿瘤包含CD14low/CD16+非经典单核细胞、CD14+/CD16+中间单核细胞、CD16-粒细胞、树突状细胞(DC)或未成熟髓细胞。在所有样本中，淋巴细胞室主要由T细胞组成，NK细胞和B细胞较少。
主成分分析(PCA)表征群体的相对丰度，MG、MDM、中性粒细胞、CD4+和CD8+ T细胞是大脑TME的主要免疫细胞（图 1E）。 BrM中淋巴细胞的比例显著增加（图 1F）。 黑色素瘤-BrM具有最丰富的淋巴细胞浸润，其中CD8+T细胞占比较大。 在某些BrM中检测到调节性T细胞(Treg)，而在胶质瘤中很少见 。
图1 脑恶性肿瘤的免疫细胞组成
T-MG和T-MDM的分析
Analysis of T-MG & T-MDM
由于T-MG和T-MDM在脑恶性肿瘤的骨髓隔室中的突出地位，使用全切片的IF染色量化MG (CD45+、P2RY12+/CD68+、CD49D-)、MDM (CD45+、P2RY12+/CD68+、CD49D+)、非免疫细胞(CD45-)和非TAM免疫细胞(CD45+, P2RY12−/CD68−, CD49D−/+)。通过额外的样本（n = 711 个样本）中的MG和MDM比例，估计验证了IDH-mut神经胶质瘤中MG的富集和IDH-wt神经胶质瘤中MDM的富集（图 2D）。
图2 MG和MDM丰度分析
进一步分析TAM和组织类型（即参考 MDM、非肿瘤脑、胶质瘤和 BrM）和细胞类型（即 MG 和 MDM）影响的基因（图 3A）。结果表明，TAM转录组变化受大脑TME本身以及特定类型的恶性肿瘤的影响。分析T-MG 或T-MDM的胶质瘤和BrM中上调的基因，结果表明，细胞在进入脑肿瘤环境时经历了巨大的变化（图 3B）。在T-MG和T-MDM中，不同病肿瘤的共有基因数量高于同一肿瘤类型中这两个细胞群之间的共有基因数（图 3B）。T-MG和T-MDM在胶质瘤和BrM中的多种转录编程，包括典型的M1（IFNγ）和M2极化（IL4），还有与慢性炎症刺激相关的表达变化、暴露于游离脂肪酸，这些与骨髓细胞功能调节有关（图 3C）。为了了解哪些过程与这些反应相关并可能驱动这些反应，分析了胶质瘤和 BrM的MG和MDM 中leading edge metagene (LEM)，每种细胞类型多达5个不同的LEM。与有丝分裂和细胞增殖相关的LEM存在于胶质瘤和BrM的T-MG和T-MDM 中（图 3D）。组织切片Ki-67染色进一步验证了，IDH-wt神经胶质瘤和BrM中T-MG和T-MDM的增殖增加， IDH-mut神经胶质瘤中的T-MG增殖也增加（图 3E）。
在胶质瘤、BrM T-MDM和BrM T-MG 中检测到富含I型干扰素(IFN)信号的LEM，但在胶质瘤T-MG中未检测到（图3D）。进一步探索这些基因是否由脑TME中的分泌因子直接诱导，结果表明，所有基因都被 BrM-TME-CM上调，并且在较小程度上被Glioma-TME-CM上调（图 3F）。我们还检测到BrM-MG中炎症和NF-κB信号传导相关LEM。Th17反应的LEM以及免疫细胞的募集和不同免疫细胞区室之间的相互作用仅在MDM中检测到。这些分析揭示了MG和MDM进入脑恶性肿瘤的TME后获得了多方面的激活。
图3 MG 和 MDM 在脑恶性肿瘤中多方面的极化表型
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参考文献
邀请函
——Invitation Letter
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