鉴于 RNA 的定位与其功能密切相关，开发用于跟踪 RNA 在活细胞中分布的技术极大地推进了 RNA 生物学的研究。最近，荧光蛋白标记的 Cas9 和 Cas13 在活细胞 RNA 追踪中的创新应用进一步丰富了工具箱。然而，Cas9/Cas13 平台以及广泛使用的 MS2-MCP 技术未能解决高背景噪声的问题。最近有报道称，CRISPR/Cas6 在与 RNA 上的 Cas6 结合位点 (CBS) 相互作用后会表现出构象改变。
2022年1月21日，河北科技大学韩春雨团队在Nucleic Acids Research（IF=17）在线发表题为“A Cas6-based RNA tracking platform functioning in a fluorescence-activation mode ”的研究论文，该研究利用这一特性设计了一个基于 Cas6 的开关平台，用于在体内检测目标 RNA。将split-Venus片段与内切核糖核酸酶突变的大肠杆菌 Cas6 (dEcCas6) 的两端结合，允许配体 (CBS) 激活split-Venus互补。该研究将此平台命名为基于 Cas6 的荧光互补 (Cas6FC)。
在活细胞中，Cas6FC 可以检测几乎没有背景噪声的目标 RNA。此外，只要在感兴趣的 RNA 中标记一个 CBS (29nt) 副本，就能够打开 Cas6FC 荧光，这大大降低了目标 RNA 构象和定位的潜在改变的可能性。因此，该研究开发了一种新的 RNA 跟踪平台，其固有地具有高灵敏度和特异性。
目前活细胞RNA追踪技术分为两种：荧光富集（FE）型和荧光激活（FA）型。FE 型平台通常包含两个关键组件：充当报告器或跟踪器的荧光蛋白偶联 RNA 结合蛋白 (RBP-FP)，以及在目标 RNA 上遗传构建的特定 RBP 结合序列 (RBS)。FE 型的一个突出例子是 MS2-MCP RNA 跟踪系统，其中 MCP 代表 MS2 噬菌体外壳蛋白。MCP 结合称为 MBS（MCP 结合位点）的特定 RNA 茎环结构。
为了跟踪活细胞中的目标 RNA, 感兴趣的RNA将被标记为MBS的多个副本, 以招募荧光蛋白共轭 mcp (mcp-fp), 从而使目标MBS可见。MS2-MCP系统是最早发明和使用最广泛的RNA追踪系统。之后，建立了各种类似的 FE 型 RNA 跟踪系统，包括 PP7-PCP 和 λN 。然而，FE 型平台通常具有高背景噪声的弱点。为了提高信噪比 (SNR)，使用相当高拷贝数（通常 >24 拷贝，>1000 bp）的外源串联重复 RBS 来标记目标 RNA。
大肠杆菌 Cas6 (EcCas6) 可用于真核 RNA 成像（图源自Nucleic Acids Research ）
最近，针对 RNA 成像提出了 Cas9 和 Cas13 基因编辑工具。受益于引导 RNA (gRNA) 介导的 RNA 靶向，FP 缀合的 Cas9/Cas13 可以跟踪任何感兴趣的 RNA。然而，考虑到 MS2-MCP 系统至少需要 12 个 MBS 拷贝才能获得可接受的 SNR。此外，Cas9/Cas13 相对较大的大小是一个问题，因为多个 Cas9/Cas13 报告基因在单个 RNA 上的积累可能会损害目标 RNA 的构象完整性和定位。到目前为止，MS2-MCP 平台仍然是最好的 FE 型 RNA 成像工具。
由于荧光报告基因的应用，所有 FE 型 RNA 跟踪平台都固有地受到高背景噪声的影响。FA 型 RNA 跟踪/成像平台部分解决了这一问题。FA 型平台基于双分子荧光互补 (BiFC)。例如，MCP 和 PCP（一种类似于 MCP 的 RNA 结合蛋白）分别与某个 FP 的 N- 和 C- 片段融合；由此产生的两个报告基因，MCP-FPN 和 PCP-FPC，在 RNA 靶标上的相邻 MBS 和 PBS（PCP 结合位点）将它们结合在一起之前，不会重建功能齐全的荧光蛋白。因此，FA 型平台的 SNR 大大提高。毫无疑问，当前的 FA 类型平台，如 BiFC 或 TriFC RNA 跟踪系统，在灵敏度上超过了任何 FE 类型工具。
Cas6 是 I-E 型 CRISPR 复合体的核心组成部分。它通过识别称为 CBS（Cas6 结合位点）的特定茎环 RNA 元件来结合和切割 pre-crRNA。CBS 结合诱导 Cas6 的构象变化，导致其 N 和 C 末端并列。利用这一特性，该研究将源自大肠杆菌的 Cas6 (EcCas6) 蛋白设计为 FA 型报告基因。
催化结构域突变的 EcCas6 (dEcCas6) 在其 N 端和 C 端分别附加了蛋白质 Venus、Venus-N (VN) 和 Venus-C (VC) 的非荧光部分。所得嵌合体 VN-dEcCas6-VC 在与感兴趣的 RNA 上的 CBS 结合之前没有荧光。由于荧光互补是由 Cas6 的变构开关介导的，该研究将此平台命名为基于 Cas6 的荧光互补 (Cas6FC)。因此，该研究设计了一个新的 FA 型 RNA 跟踪平台，具有良好的灵敏度和特异性。
参考消息：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac014/6513573