前言
结直肠癌（CRC）是一种常见的恶性肿瘤，在所有癌症中的发病率（6.1%）位居第三，死亡率（9.4%）居第二位。由于大肠癌的多样性和异质性，除了手术切除外，近年来很少有有效的治疗策略。
随着免疫治疗在手术后成为一种革命性的治疗方法，加上放化疗和靶向治疗，对大肠癌的治疗迎来了新阶段。免疫检查点抑制剂（ICI）治疗已成为目前应用的主要抗结直肠癌免疫治疗方法。
此外，ICIs以外的免疫疗法，如嵌合抗原受体修饰T（CAR-T）细胞或基于溶瘤病毒的免疫治疗，近年来迅速出现。这些都促进了大肠癌免疫疗法的发展。免疫治疗作为一种新的强有力的抗肿瘤治疗方法，将成为大肠癌患者的一种替代治疗策略。
结直肠癌的分类系统
MMR/MSI系统是CRC分类的最重要指标，用于制定治疗策略。微卫星是几十个核苷酸的串联重复，由一到六个核苷酸作为重复单元。微卫星不稳定（MSI）是由于重复单位的插入或删除而导致的肿瘤细胞中微卫星的移码突变。DNA错配修复（MMR）系统通过识别和修复DNA损伤，纠正DNA复制过程中错误周期导致的插入、删除或不匹配碱基，来对抗这些错误。
MMR分为错配修复功能缺陷（dMMR）和错配修复功能完整（pMMR）。dMMR表现为缺乏MMR蛋白，当MMR系统功能失调或发生突变时，这些遗传错误不会得到纠正，从而使它们永久整合到肿瘤DNA中，称为高度不稳定（MSI-H）。相反，MMR蛋白在pMMR中表达正常，主要分为低度不稳定（MSI-L）和稳定（MSS）。
大肠癌dMMR/MSI-H亚型约占所有病例的15%和mCRC病例的5%。由于dMMR/MSI-H的高突变率，肿瘤具有高免疫原性，使其能够激活免疫系统的抗肿瘤作用。dMMR/MSI-H患者对以ICI为基础的免疫治疗更具反应性。因此，寻找新的更有效的免疫治疗策略来治疗不同的CRC亚型已成为主流。
基于ICI的结直肠癌治疗策略
作为MMR蛋白缺乏的重要标志物，MSI稳定性已成为指导大肠癌患者治疗策略的一个主要指标。近年来，随着对免疫标记物的深入研究，大量研究表明高TMB可预测ICIs治疗大肠癌的疗效。MMR/MSI分类系统也有助于指导CRC患者免疫治疗策略的决策。
dMMR/MSI-H结直肠癌的治疗策略
由于大多数dMMR/MSI-H CRC亚型具有高TMB，ICIs和免疫疗法对高TMB患者具有极好的治疗效果。因此，ICI免疫治疗策略已成为dMMR/MSI-H亚型患者的主要临床治疗方法，包括PD-1抑制剂（pembrolizumab或nivolumab）单药治疗、PD-1抑制剂和CTLA4抑制剂联合治疗（nivolumab+ipilimumab）、以及PD-L1抑制剂和抗VEGF抗体联合治疗（atezolizumab+ bevacizumab）。
一项临床研究（NCT02060188）中招募了74名MSI-H亚型患者，并用nivolumab治疗。治疗后，约68.9%的患者疾病控制超过12周；此外，8名患者（34.8%）经历了持续超过12个月的免疫应答，表明nivolumab为dMMR/MSI-H mCRC患者提供了长期应答和疾病控制。
更有趣的是，在MSI-H亚型患者中，ICIs的联合策略似乎发挥了更大的抗肿瘤作用。2018年，进行了一项nivolumab和ipilimumab联合治疗MSI-H肿瘤的研究。在119名患者中，联合治疗在12周时实现了80%的有效肿瘤控制，并且维持了94%以上的免疫应答。所有这些数据表明，PD-1抑制剂和CTLA4抑制剂的联合策略导致更高的免疫应答率和更长的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS），促使美国食品和药物管理局（FDA）批准nivolumab联合ipilimumab用于dMMR/MSI-H亚型患者的治疗。
pMMR/MSS结直肠癌的治疗策略
最近，一项分别使用PD-L1和CTLA4抑制剂durvalumab和tremelimumab的随机试验用于支持性pMMR/MSS结直肠癌治疗。180例大肠癌患者被分为D+T组（durvalumab+tremelimumab）和BSC组（最佳支持治疗）。尽管两组的客观响应率（ORR）和PFS相似，但D+T组的OS有所改善。这为pMMR/MSS mCRC的免疫治疗带来了新希望。
然而，临床获益仅限于CRC亚型的一小部分患者，约占所有CRC患者的4%。对于pMMR/MSSCRC亚型，ICI治疗不能达到最佳疗效。当存在MSI时，肿瘤细胞释放许多通常位于肿瘤膜内的肿瘤相关抗原（TAA），然后被位于肿瘤免疫微环境中的抗原呈递细胞（APC）吸收和呈递，增强T细胞的抗肿瘤能力。然而，对于大肠癌的pMMR/MSS亚型，DNA结构过于稳定，无法释放TAAs，从而阻止免疫系统激活或诱导激活的免疫细胞无法识别肿瘤细胞。因此，一些研究表明PD-1抑制剂对pMMR/MSS CRC亚型患者的疗效较差，迫切需要新的治疗策略来增强pMMR/MSS大肠癌患者的肿瘤免疫。
迄今为止，许多研究表明，化疗、分子靶向治疗和放疗会导致癌细胞的免疫原性细胞死亡（ICD）。ICD后，肿瘤细胞暴露于大量TAA，释放损伤相关分子模式和促炎细胞因子，有效促进免疫细胞浸润，激活APC。这些可能为免疫应答低下的pMMR/MSS大肠癌患者提供新的免疫治疗策略。
pMMR/MSI-L结直肠癌的治疗策略
对于pMMR/MSI-L CRC亚型患者，癌细胞的微卫星稳定性介于MSI-H和MSS亚型之间，因此，该亚型几乎没有特定的肿瘤特征。迄今为止，MSI-L亚型常用的免疫治疗策略分为三类：CTLA4抑制剂（ipilimumab）、PD-1抑制剂（pembrolizumab或nivolumab）和PD-L1抑制剂（atezolizumab或durvalumab）及其组合。因此，FDA已批准pembrolizumab和nivolumab的组合以及nivolumab和ipilimumab的组合用于治疗CRC。
ICIs对MSI-L亚型并非绝对有效。在2015年的一项研究中，观察到pembrolizumab治疗对pMMR/MSI-L肿瘤患者没有产生良好的免疫介导的抗肿瘤作用。此外，在另一项研究中，142名pMMR/MSI-L患者对免疫治疗的反应有限，20名患者中只有一名对PD-1和CTLA4抗体的组合表现出免疫介导的抗肿瘤反应。
近年来，随着新的ICI联合治疗策略的发现，在提高此类肿瘤患者的联合免疫治疗效果方面取得了实质性进展。在2015年发表的研究中，PD-L1抑制剂和MEK抑制剂联合应用对pMMR/MSI-L大肠癌患者显示出显著疗效。RAS–MAPK通路是多个膜受体跨膜转导生长信号，其活化与T细胞减少肿瘤浸润有关，直接促进肿瘤细胞增殖。
根据免疫细胞浸润程度分类的治疗策略
由于大肠癌中广泛的染色体改变和dMMRs，不同大肠癌细胞之间存在遗传异质性。根据3000例大肠癌患者的病理学和分子生物学数据，Guinney将大肠癌患者分为四个亚型：CMS1，微卫星不稳定免疫型（14%），其特征是MSI-H高突变，同时显示BRAF突变和强免疫细胞浸润；CMS2是最常见的类型（37%），其特征是WNT和MYC通路激活和染色体不稳定性；CMS3，代谢型（13%），主要以KRAS突变、混合MSI状态和异常代谢途径为特征；CMS4是一种间充质亚型（3%），其特征是转化因子TGF-β激活，血管生成、间质浸润和炎症浸润增强。
在这四种亚型中，CMS1和CMS4亚型的特征是更广泛的淋巴细胞浸润和肿瘤周围更高分布的炎性细胞因子，而CMS2和CMS3亚型几乎没有淋巴细胞或炎性细胞浸润。因此，根据淋巴细胞浸润的存在和肿瘤周围的炎症环境，基于CMS系统的四种结直肠癌亚型又被人为分为两种类型，热结直肠癌和冷结直肠癌。
热结直肠癌的治疗策略
热大肠癌的TME包含许多淋巴细胞和炎性浸润，主要包括CMS1和CMS4亚型。CMS1型是大肠癌免疫治疗的主要潜在受益者，2016年的一项研究表明，当大量侵袭性T细胞，尤其是细胞毒性CD8+T细胞在TME中积聚时，患者的PFS和OS会延长。他们在CMS1亚型肿瘤中检测到大量浸润性T细胞和B细胞，这为ICIs的治疗策略提供了强有力的保证。
CMS4是第二大亚型，约占CRC病例总数的23%。主要表现为转化因子TGF-β激活、血管生成增强、间质浸润和炎症浸润。然而，与CMS1不同，CMS4具有不利的炎症免疫表型，导致免疫微环境差，活性T细胞无法杀死肿瘤细胞。因此，在CMS4亚型中很少研究ICIs的治疗策略。选择性TGF-β抑制剂联合ICIs可能有助于CMS4患者的免疫治疗。此外，CMS4促进微环境中血管生成和VEGF相关因子（如FGF）的表达增加，消除VEGF或减少其表达和释放的方法已成为另一个研究方向。目前，许多临床研究正在调查VEGF抑制剂联合ICI对大肠癌的疗效。
冷结直肠癌的治疗策略
CMS2和CMS3亚型是冷结直肠癌的主要代表性类型。CMS2亚型是最常见的亚型，约占所有CRC病例的37%，CMS2和CMS3亚型的主要特征是TME缺乏肿瘤免疫原性。已有研究表明，ICIs药物单独使用效果不佳，这与冷结直肠癌的免疫抑制性质有关。目前，已经开发了多种免疫治疗策略，例如溶瘤病毒、细胞因子治疗、CAR-T治疗和针对TAAs的被动免疫治疗，这些策略有助于冷肿瘤的免疫激活抗肿瘤治疗。
化学免疫治疗策略
ICIs一直是大肠癌最成熟、最有效的免疫治疗方法。然而，它似乎仅限于免疫原性低或免疫细胞浸润低的CRC亚型。因此，单独使用ICIs进行免疫治疗对某些特定的CRC亚型无效，化学免疫疗法已成为治疗大肠癌的重要策略。
为了进一步提高FOLFOX或FOLFIRI策略治疗的大肠癌患者的生存率，开发了一种新的GOLFIG策略。这种策略在FOLFOX和化疗药物吉西他滨的基础上结合了低剂量重组IL-2和GM-CSF。在GOLFLG策略中，多种化疗药物可以成功地大量摧毁肿瘤细胞，而rIL-2和GM-CSF将促进APC的激活，然后激活CTL，准确地摧毁剩余的肿瘤细胞。Correale等人首先探索了FOLFIG试验的效果，他们发现mCRC患者的缓解率和疾病控制率高于FOLFOX策略，表明有显著的免疫反应和抗肿瘤活性。
溶瘤病毒和CAR-T细胞治疗
近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了越来越多的关注，相关研究也取得了很大进展。溶瘤痘苗病毒（VV）治疗策略已被证明通过促进免疫细胞的浸润将结直肠癌类型的冷肿瘤转化为热肿瘤，从而产生有效的抗肿瘤免疫。然而，溶瘤病毒的治疗潜力也受到肿瘤对免疫细胞的免疫抑制的影响，如免疫检查点。根据Wei发表的研究，与单纯溶瘤VV治疗相比，VV联合抗TIGIT单克隆抗体的策略在降低肿瘤负荷和延长生存期方面发挥了更好的作用。总之，溶瘤病毒联合ICIs可能是治疗大肠癌的一个新方向。
对于CMS2和CMS3 CRC亚型，低水平的免疫细胞浸润是导致免疫反应差的主要因素，CAR-T细胞疗法的出现已成为解决这一难题的主要和精确的治疗策略。2017年，Zhang等人对CEA高表达的大肠癌进行了CAR-T治疗的一期临床试验（NCT02349724）。在该试验中，10名大肠癌患者接受了5次递增剂量的CAR-T细胞治疗，随访期间未观察到与CAR-T治疗相关的严重不良事件。10名患者中有7名在先前治疗时有所进展，但在CAR-T治疗后情况稳定，影像学分析显示两名患者治疗后肿瘤缩小。
2019年，Ying等人将截短的CD19（CD19T）基因加载到溶瘤病毒中，增加肿瘤细胞膜表面CD19抗原的表达。同时，他们将CAR-T免疫疗法与嵌合的CD19基因相结合，以增强CAR-T的特异性靶向作用。溶瘤病毒与截断的CD19（OV-CD19T）的结合在不同的实体肿瘤细胞中特异性复制和表达CD19T抗原，OV-CD19T和CD19-CAR-T联合治疗在体外和体内都是一种安全有效的治疗实体瘤的方法，提示具有持久的肿瘤杀伤作用。
癌症免疫疫苗
含有TAAs或肿瘤特异性抗原（TSA）的治疗性癌症疫苗可直接刺激免疫系统，激活CD4+和CD8+T细胞以杀死肿瘤。已经开发出许多癌症疫苗，包括细胞疫苗、核酸疫苗、蛋白肽疫苗和基因工程疫苗。
胸苷酸合成酶多表位肽（TSPP）是一种抗癌多表位肽疫苗，可通过APC促进肿瘤抗原的交叉呈递，并触发具有多抗原特异性的高度特异性免疫反应。TSPP在结直肠癌的临床前研究中显示出良好的抗肿瘤活性。
此外，免疫治疗反应通常与TMB有关，dMMR/MSI-H患者具有较高的基因突变特征。因此，针对特定基因突变相关抗原的疫苗已被证明对这种类型有效。2017年，Maletzki等人构建了MLH1基因敲除诱导的dMMR小鼠模型，在给小鼠注射dMMR癌症疫苗治疗后，OS时间延长，肿瘤突变负荷减少，表明特异性疫苗是治疗dMMR亚型的可行选择。
免疫佐剂
免疫佐剂是一种非特异性免疫增殖剂，是一种有效激活抗原免疫应答或改变免疫应答类型的佐剂，对提高大肠癌免疫治疗效果具有重要意义。目前，免疫佐剂主要分为生物佐剂和非生物佐剂，生物佐剂具有较好的免疫增敏作用。
在一项I期临床试验中，使用Mn2+结合抗PD-1抗体安全地提高晚期mCRC治疗的抗肿瘤疗效。2018年至2019年，Lv等人启动了一项关于Mn2+对晚期mCRC影响的I期临床试验。在这项研究中，通过鼻内或吸入方式给药，经MnCl2溶液治疗后的临床ORR为45.5%，肿瘤控制率为90.9%。更重要的是，5名先前对抗PD-1抗体或化疗联合放疗无效的患者在治疗期间表现出良好的DCR，这表明Mn2+恢复了免疫治疗抵抗患者的免疫治疗效果。作为一种无机佐剂，Mn2+无疑已成为大肠癌免疫治疗中最重要的免疫增敏剂，它有可能激活免疫治疗耐药大肠癌患者的免疫反应，提供一种新的更有效的治疗策略。
结直肠癌免疫治疗的挑战
作为继手术、放疗、化疗和靶向治疗之后的一种有效治疗策略，免疫治疗策略在大肠癌的治疗中显示出强大的抗肿瘤疗效和强大的治疗潜力。然而，作为一种新兴的治疗方法，在安全性和有效性方面仍然存在许多挑战。
对于ICI治疗策略，尽管部分CRC亚型显示出良好的治疗效果，但对于其他一些CRC亚型，如pMMR/MSS和dMMR/MSI-L，效果并不理想。需要通过探索其具体机制来开发更多新的ICI组合策略。另一方面，由于实体瘤和外部微环境的异质性，实体瘤免疫治疗的效果不如预期。低临床靶向应答率和自身免疫性疾病的风险仍然是主要限制因素。治疗期间免疫系统过度活跃可能导致大肠癌患者出现严重不良反应。
近年来，越来越多的ICIs联合疗法被开发出来，解决了ICIs仅用于结直肠癌治疗的一些局限性。然而，尽管有更多的大肠癌免疫治疗策略正在开发中，但仍然没有针对大肠癌免疫环境特征的详细分类。一个更有意义的方法是根据大肠癌的不同免疫反应特征制定分类。
小结
目前，提高肿瘤的免疫原性，同时增加免疫系统的靶向性和改善免疫细胞的侵袭性已成为增强结直肠癌免疫治疗的重要治疗策略。包括化疗、靶向治疗、溶瘤病毒、CAR-T治疗、肿瘤疫苗与检查点抑制剂的联合应用成为未来重要的方向。总之，作为目前最有希望的抗肿瘤治疗方法，免疫治疗作为大肠癌的一种治疗策略具有很大的潜力，这可能给大肠癌患者带来新的希望。
参考文献：
1. Progress in the Application of ImmuneCheckpoint Inhibitor-Based Immunotherapy for Targeting Different Types ofColorectal Cancer. Front Oncol. 2021; 11: 764618.