目前，由SARS-CoV-2感染导致的COVID-19席卷全球，已成为全球公共卫生关注的焦点【1】。截至2021年12月2日，COVID-19确诊病例达2.6亿人，死亡病例达521万人。虽然灭活疫苗、基因工程疫苗、5型腺病毒活载体疫苗和mRNA疫苗的上市有效地阻断了SARS-CoV-2的大流行并显著地降低了COVID-19重症发病率，但面对SARS-CoV-2高频基因突变导致的传染性升高和疫苗保护力下降等问题，尤其是德尔塔突变株的全球蔓延导致了COVID-19确诊病例数量再度激增，积极开发新型广谱抗冠状病毒药物刻不容缓【2-3】。
作为半胱氨酸蛋白酶的Mpro在致病性β-冠状病毒中的进化相对保守，不易突变，参与调控新冠病毒RNA复制与转录。Mpro对多聚蛋白质体的水解过程是新冠病毒RNA复制与转录过程中不可或缺的关键步骤。鉴于Mpro进化保守且人体缺乏其同源蛋白酶，这使Mpro成为广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一[4-5]。在高选择性Mpro抑制剂的开发过程中，建立简便、快速、灵敏、经济的药物高通量筛选模型是其高效筛选与开发的重要基础和关键技术。目前已报道的Mpro小分子抑制剂筛选方法主要包括虚拟筛选法、荧光共振能量转移法、荧光素酶报告基因筛选法、绿色荧光蛋白剪切互补法和表型筛选法等【6-10】。但上述筛选方法普遍存在假阳性率高、筛选成本高、操作繁琐、稳定性差、筛选周期长等缺点，较大地限制了其在大规模高通量筛选中的应用。因此，积极开发简便、快速、灵敏、经济的新型Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型具有重要意义。
2021年12月5日，皖南医学院陈云雨副教授团队联合中国医学科学院-北京协和医学院医药生物技术研究所司书毅教授团队在Cell & Bioscience杂志发表了题为“Development of a simple and miniaturized sandwich-like fluorescence polarization assay for rapid screening of SARS-CoV-2 main protease inhibitors”的研究论文，首次报道了一种新型基于荧光偏振（fluorescence polarization）技术和生物素-亲和素反应（biotin-avidin system）原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选方法。
研究团队以荧光探针FITC-S-Biotin（FITC-AVLQSGFRKK-Biotin）作为新冠病毒Mpro水解底物，成功建立了Mpro小分子抑制剂三明治样荧光偏振高通量筛选模型。活性化合物可以抑制Mpro对FITC-S-Biotin的水解作用，故此FITC-S-Biotin可与亲和素结合，分子量增大，旋转速度变慢，在荧光偏振筛选模型中表现较高的mP值；非活性化合物由于不能抑制Mpro对FITC-S-Biotin的水解作用，将切割FITC-S-Biotin产生分子量较小的FITC-AVLQ片段，旋转速度加快，在荧光偏振筛选模型中则表现较低的mP值。应用本筛选模型对天然产物化合物库进行高通量筛选, 成功筛选到新型竞争性抑制剂二鹅掌菜酚（dieckol）具有良好的抑制活性，其IC50值为4.5±0.4 μM。表面等离子共振实验结果表明，二鹅掌菜酚与Mpro具有较高的亲和力，KD值为0.22 μM。分子对接结果表明，二鹅掌菜酚能与Mpro活性中心形成牢固的氢键，证实了其竞争性结合模式。与常规的FRET筛选方法相比，在本荧光偏振筛选模型中，底物的单孔使用量仅为20 nM，为FRET筛选模型中底物单孔使用量的1/500，且操作简便，每轮筛选时间仅为1 h，展现了良好的稳定性、灵敏性和经济性，对其他致病性病毒蛋白酶抑制剂的高效筛选与发现也具有重要的借鉴和参考价值。此外，由于荧光偏振检测中FITC的发射光为535 nm，更好地避免了天然产物自身荧光对筛选模型可靠性的干扰。2021年7月1日，针对本筛选方法的建立与应用，研究团队正式提交了国家发明专利申请，目前专利内容已正式公布（申请公布号：CN113699212A）。
皖南医学院2020级药理学硕士研究生闫干干和中国医学科学院-北京协和医学院医药生物技术研究所2019级博士研究生李东升为论文第一作者，中国医学科学院-北京协和医学院医药生物技术研究所张晶副教授、司书毅教授和皖南医学院陈云雨副教授为论文通讯作者。此外，中国医学科学院-北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室林媛副教授在分子对接研究中给予了帮助和支持。
原文链接：
https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-021-00720-3
制版人：十一
参考文献
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