程颖 | 衢州市人民医院检验科主管技师
翁亮亮 | 衢州市人民医院感染科主治医师
前 言
隐球菌病是由隐球菌感染引起的一种全球性的真菌病。人类对隐球菌的研究已有一个多世纪，但由于自然气候的变化、隐球菌自身不断的进化及易感人群的增多等因素，隐球菌病已成为一种常见的机会感染性疾病。
隐球菌最常见的感染部位是中枢神经系统，但近年来，肺隐球菌病发病率逐年增高，其临床表现、影像学表现无特异性，容易误诊或延迟诊断而使病情恶化。隐球菌荚膜多糖抗原检测由于其较高的敏感性和极高的特异性，对临床诊断起到关键的作用。本病例分享了一例隐球菌荚膜抗原阴性的隐球菌肺炎病例的诊疗全程。
案例经过
病史简要：男性患者，38岁，因“咳嗽1月余”入院，表现为阵发性干咳，夜间为主，无畏寒发热，无胸痛咯血。
辅助检查：WBC 7.2*10^9/L,N% 61.8%,RBC 4.98*10^9/L，HCRP 2.20mg/L”。胸部CT提示：左肺下叶可见多发结节影及斑片影，部分病灶内可见厚壁空洞，未见明显壁结节，边界不清。
既往史：乙型病毒性肝炎史；鼻窦手术史；安可欣过敏。
图1 胸部CT（2020-12-2）
入院查体：T37.2℃，P98bpm，R18bpm，SPO2：98%。神志清，精神一般，无异常体征。
实验室检查：
血沉：3mm/h；降钙素原：0.04ng/ml；超敏C-反应蛋白：2.20mg/L。免疫球蛋白E：88.72IU/mL。结核感染T细胞：阴性；痰找抗酸杆菌：阴性；痰GeneXpert检测：阴性。
隐球菌荚膜抗原：阴性。肿瘤标记物：正常范围。抗核抗体测定：均阴性。
辅助检查：
心电图：正常心电图。肝胆胰脾泌尿系前列腺彩超：胆囊息肉；前列腺钙化灶；心彩超：二尖瓣、三尖瓣少量反流。
胸部增强CT+病灶三维重建：左肺下叶多发结节、斑片影，与2020-12-2CT对照：较前空洞相仿，余较前相仿，首先考虑感染性病变，结核？
临床案例分析
病史特点：患者青年男性，急性起病，主要为夜间干咳，胸部CT可见左肺下叶感染性结节、空洞，炎症指标及血常规未见明显异常，结核相关化验结果为阴性。入院后予以左氧氟沙星抗感染治疗。病灶未见明显吸收好转。
肺部结核的诊断与鉴别诊断如下：
原发性肺癌：患者青年，亚急性起病，否认吸烟史，无发热，炎症指标正常，胸部影像学提示孤立实性肺结节，直径<2cm，虽肿瘤标记物正常，原发性肺癌等肺恶性肿瘤不除外。考虑患者年龄、结节大小及吸烟史，首先考虑感染性病变，可建议随访观察病灶进展或进一步行病灶活检以明确诊断。
肺隐球菌病：本患者无发热等症状，炎症指标正常，肺内病变主要为位于胸膜下的孤立结节，虽然隐球菌荚膜抗原阴性，但抗细菌治疗效果不佳，肺隐球菌病不能除外。肺组织活检送病理以及PAS、六胺银等特殊染色染色、微生物学涂片及培养、病原学mNGS等检查明确诊断。
分枝杆菌肺病（结核或非结核分枝杆菌）：一般有低热、盗汗、乏力、潮热、咳嗽、咯血等结核中毒症状，抗细菌治疗后病灶无好转，肺结核或非结核分枝杆菌肺病不除外，但结核感染T细胞阴性、痰GeneXpert阴性、痰找抗酸杆菌阴性，且病灶非多发性、无卫星灶，分枝杆菌肺病可能性小，可进一步行痰分支杆菌培养、肺组织活检送病理、抗酸染色及分枝杆菌培养等协诊。
肺良性肿瘤：患者一般情况良好，抗感染后病灶无明显改变，较常见的错构瘤以及较少见的纤维瘤、平滑肌瘤、肺细胞瘤等肺良性肿瘤不除外，明确诊断依赖组织病理检查。
进一步诊疗
为明确诊断进一步检查，在与患者积极沟通交流后，同意进行肺活检穿刺。
2020-12-7在CT引导下肺穿刺活检，病灶组织送检。穿刺组织活检诊断意见：肉芽肿性炎，可疑隐球菌感染，并见小区肺泡上皮增生，待特殊染色后进一步辅助诊断。
2020-12-13微生物延长培养后检到隐球菌，立即电告临床肺穿组织标本中培养到：新型隐球菌。临床修正诊断为：肺隐球菌病予以停左氧氟沙星，改用改用氟康唑（大扶康）0.4givgtt Qd 抗真菌治疗，同时予以护肝对症治疗。
由于诊断考虑肺隐球菌病，于2020-12-14完善了腰椎穿刺术。腰椎穿刺：脑脊液压力：70mmH2O；脑脊液常规：潘氏试验：阴性、有核细胞：0个/UL；脑脊液生化：糖：3.99mmol/L、乳酸脱氢酶：12.7U/L、蛋白定量：0.40g/L；隐球菌未见。
2020-12-14病理补充报告：肉芽肿性炎及小区肺泡上皮增生，结合特殊染色结果，考虑隐球菌感染。特殊染色提示：PAS(+)，六氨银（+），抗酸（-）。
出院及随访
患者治疗后无明显咳嗽咳痰、胸闷胸痛，脑脊液隐球菌检测阴性。予带药出院。出院后2020-12-22日回报肺组织（2020-12-7采样）真菌培养及药敏结果。
2020-2-1复查胸部CT提示：左肺下叶少量斑片影，对比前片明显吸收减少。
检验案例分析
1、隐球菌荚膜抗原试验的假阴性原因？
隐球菌的荚膜多糖抗原是主要的致病因子，是血清和脑脊液的特异性抗原基础，主要方法有酶联免疫、乳胶凝集、胶体金免疫层析法。乳胶凝集法存在类风湿因子、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者、巨球蛋白、系统性红斑狼疮、结核杆菌可造成假阳性。
但在感染早期，荚膜抗原浓度太低；血清中有免疫复合物；高浓度的前带效应可能造成假阴性。酶联免疫方法在其他微生物如毛孢子菌、抗酸杆菌时可造成假阳性。荚膜抗原浓度太低，或血清中有免疫复合物，可造成假阴性。
此两种方法是应用最广的抗原定量或半定量的检测方法。胶体金免疫层析法属于定性方法，的灵敏度和特异性菌高于另两种方法，在诊断血清和脑脊液隐球菌病的敏感性和特异性高达98%和99%。
亦有文章指出3种方法的灵敏度和特异度的差异无统计学意义，均在95%以上。而在诊断孤立性肺隐球菌病中，隐球菌荚膜抗原试验存在敏感性不足的限制，在非HIV的单纯肺隐球菌感染者或无症状感染者中，隐球菌荚膜抗原试验阳性率仅50%-60%[1]。因此，对于此类症状患者进行隐球菌荚膜抗原试验筛查时应特别注意假阴性的问题。
2、为何这株隐球菌生长缓慢？
隐球菌一般2-3天可见奶油状小菌落生长，5天生长成熟，少数2-3周才可见生长。此病例中培养到的隐球菌为慢生长隐球菌，生长缓慢，因此报告时间较长。隐球菌生长特点为：致病性隐球菌在25℃和37℃中生长，40-42℃不发育，所以鸟类体温较高，不易被感染，而鸽粪可成为隐球菌的传染源之一。
人体早期吸入雾化颗粒中的隐球菌孢子，有3种结局：⑴可能完全清除病原体且不引起宿主反应。⑵进入疾病潜伏期。进入潜伏阶段后，因为宿主的高浓度二氧化碳、低氧、营养有限的环境，不利于孢子生长，孢子可进入静止状态，停止或缓慢生长，降低营养的消耗或进入休眠的非复制阶段[2]。⑶形成肺实质或其他组织的侵袭性隐球菌病。
在此病例中，取得的穿刺肺组织标本中残存隐球菌因患者免疫功能正常而处于非生长期，当接触到培养基等营养物质，且培养环境改变时，恢复生长，因此在培养基上表现生长缓慢，因此，对于隐球菌培养需4周以上方可报告培养阴性。
知识拓展
隐球菌侵袭性感染：隐球菌是自然界的腐生寄生菌，主要存在于鸽粪、土壤和桉树中，隐球菌的流行和传播还受酸碱度、湿度、温度、阳光、风力等多种环境因素的影响[3]。孢子被人体吸入后进入肺中，首先被巨噬细胞相关的表面受体识别，被巨噬细胞吞噬，并刺激巨噬细胞释放CCL2，后者会募集单核细胞和树突状细胞并产生促炎性细胞因子。
如果隐球菌没有被清除，可以存活定植肺泡中，并挟持巨噬细胞在再进行复制，若患者免疫系统缺陷，真菌可通过肺泡间隙进入循环系统，逃避机体免疫识别及巨噬细胞吞噬杀伤后播散全身，大多可穿过血脑屏障侵入中枢神经系统，引起脑膜炎。
隐球菌的主要毒力因子有荚膜、黑色素、漆酶、尿素酶和磷脂酶。荚膜多糖是隐球菌主要的毒力因素，抗巨噬吞噬，诱使动物免疫无反应性、降低机体抵抗力，各种毒力因子使隐球菌产生有利于病原体存活的特定酶和结构之外，其结构还对宿主特异性信号传导起主动调动作用。
隐球菌感染的高危因素包括：淋巴细胞减少、既往使用激素、淋巴瘤、免疫功能缺陷患者。肺为最常见感染部位，除了可以引起肺隐球菌病还可以从肺部播散至全身其他脏器，皮肤、粘膜、淋巴结、骨、内脏等均可受累，最易侵犯中枢神经系统引起隐球菌性脑膜炎，预后不良，常可导致患者死亡。
案例总结
综合分析，在肺隐球菌病的鉴别诊断中应审慎对待环境暴露的意义，存在高危环境暴露可以作为支持肺隐球菌病诊断的因素，但却不宜将缺乏高危环境暴露作为排除隐球菌病的依据。另外对于隐球菌荚膜抗原试验也因进行多方面考量，可能会出现假阳性和假阴性。
对于单纯肺隐球菌感染者、无症状感染者、仅表现为胸痛或咳嗽的患者因注意隐球菌荚膜抗原试验的假阴性。，还应依靠组织学、细胞学和培养、mNGS等方法进行病原学确诊，以防止漏诊和误诊。
专家点评
陆军：衢州市人民医院检验科主任技师
由于肺隐球菌病早期临床症状不典型，可表现为咳嗽、咳痰、胸痛、发热等，亦可无症状体检时发现；亦可呈急性肺炎表现，高热、气急、低氧血症等。肺隐球菌病胸部CT主要表现：多分布于肺野外侧带或胸膜下，下叶多见，主要表现有：⑴结节或肿块影⑵斑片实变影⑶弥漫性粟粒影⑷间质性肺炎型⑸混合型。影像学的不典型需与肺恶性肿瘤、其它感染性肉芽肿以及肺良性肿瘤相鉴别。目前，隐球菌的确诊依据主要有：活检组织病理学；血液和无菌体液（如脑脊液、胸液）隐球菌镜检或培养；基因检测。除此之外，隐球菌隐球菌荚膜抗原试验因无创、方便快速，常作为临床首选辅助检查诊断侵袭性隐球菌病。但是隐球菌荚膜试验还应注意假阴性存在。该病例的诊疗分析中充分体现临床、检验之间的相互合作与沟通，检验科通过检验报告的解读使临床更好的掌握检验项目的意义；病原菌的分析及培养检出能力为临床诊疗提供可靠的病原学结果。
总之，遇到可疑问题、疑难病例检验与临床应充分沟通，做到有的放矢。减少盲目性，做到更早的确诊与治疗。
参考文献
[1]陈良安,佘丹阳,梁志欣,等. 中国HIV阴性宿主肺隐球菌病前瞻性多中心临床研究[J]. 中华结核和呼吸杂志,2021,01:14-27.
[2]Alanio A. Dormancy in Cryptococcus neoformans: 60 years of accumulating evidence. J Clin Invest. 2020 Jul 1;130(7):3353-3360.
[3]Chowdhary A, Rhandhawa HS, Prakash A, Meis JF. Environmental prevalence of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii in India: an update. Crit Rev Microbiol. 2012 Feb;38(1):1-16.
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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼