生命体从孕育到诞生，再到生长和成熟，DNA都在不停地进行复制，转录和翻译又会把DNA信息传递到蛋白质中，这些蛋白构成生命体本身或参与着各类重要的生理生化反应。DNA作为最核心的模板，它的错误如果被传递到蛋白中，会造成机体某些功能的失调，这也是很多遗传病的致病原因。
有人把DNA信息比喻为程序的编程语句，我们可以把DNA翻译过程中偶尔出现的错误视为程序在运行过程中的bug，程序员会通过修改代码来解决bug，那么生命体的错误，也可以从DNA水平进行干预和解决。基因疗法便是能从DNA水平修复遗传缺陷的一种新兴疗法。
基因疗法发展至今已有多个大类和众多特色技术，例如利用病毒载体递送基因的技术已很成熟，且有了多款上市药品，还有多种非病毒载体递送技术和利用基因编辑器进行基因操作的技术也在迅猛发展。
本文我们将重点放在基因编辑技术领域。基因编辑被誉为过去10年中生物医学领域最具革命性的突破之一，CRISPR系统的两位先驱也获得了2020年诺贝尔化学奖。通过对特定基因进行删除、替换或校正，这一技术给予了许多因DNA水平出现错误而导致的疾病一个从根源上治愈的机会。
体内基因编辑的困境与优势
首先我们以CRISPR-Cas9这一经典的基因编辑系统为例了解一下基因编辑的工作机制。
CRISPR是细菌用于抵御外源遗传物质的“基因武器”，细菌会将入侵的病毒DNA序列整合到CRISPR序列中来“记住”入侵者的DNA，所以CRISPR序列类似一个“黑名单”。当这些外源遗传物质再次侵入细菌内时，Cas9蛋白能够识别并切割具有匹配序列的所有DNA分子。
现在研究人员使用的CRISPR-Cas9系统由gRNA引导Cas9至需要切割的DNA位点进行切割，细胞会感应到DNA双链的断裂并启动DNA修复机制，修复会产生两种结果：敲除基因或插入新基因。
实现基因编辑的渠道分为两种，一种是体外基因编辑，通过将从患者体内采集的细胞在体外进行基因编辑后，再作为治疗药物重新注入患者体内。另一种是体内基因编辑，基因编辑过程发生在体内细胞中。也可以将体内基因编辑疗法理解为基因编辑器本身是一种疗法，而体外基因编辑疗法是由基因编辑器修饰和改造的疗法。
体内和体外基因编辑疗法
这两者最大的不同不只是编辑过程发生在离体细胞还是体内细胞，更多的是基因编辑操作的可控性和疗法的安全性。
想象一下，一种是为患者输入在体外经过层层筛选得到的“精英”细胞，另一种是将基因编辑系统直接注入人体进行治疗，两者都会面临基因编辑器脱靶编辑风险，但后者会因为这一过程不在体外发生而提高调控难度，而且核心组件核酸酶在体内的长时间表达也会增加脱靶编辑的风险。
当然体内基因编辑也有它独特的优势。像造血干细胞这类细胞，在体外进行基因改造后的存活率很高，但是有些细胞经基因改造后存活率很低或者无法存活，神经元就是最典型的细胞类型，它会在基因编辑后死亡或在后期培养中失去功能。所以体外基因编辑可能并不适用于一些神经系统遗传疾病。
因此，体内基因编辑虽然风险较高，但它如果成功，就意味着拥有更多的靶细胞和靶器官，更多的目标适应症。未来需要更多的工作来提高编辑系统的安全性，并提高基因编辑的效率。
谁是胜者？
在众多已公开或进入临床的基因编辑疗法中，所针对的适应症多为血液疾病，这些疗法基本都是体外基因编辑疗法，体内基因编辑疗法较少。
除了最出名的CRISPR/Cas编辑器，基因编辑器还有另外两个大类，分别为锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应器核酸酶（TALEN），我们可以从不同编辑器开发领域的进展来一睹谁跑在体内基因编辑疗法赛道的最前方。
开发ZFN的代表企业是Sangamo Therapeutics，公司管线中进展最快的项目是AAV基因疗法和由锌指蛋白技术开发的细胞疗法；开发TALEN的代表企业是Cellectis，Cellectis将TALEN应用在了细胞疗法的开发中，管线中现有的项目均为CAR-T细胞疗法；而开发CRISPR/Cas编辑技术的公司数量则是两只手都数不过来，而且还有碱基编辑（base editing）和先导编辑（prime editing）等技术继续被开发出来，但是目前项目进展最快的依然是由CRISPR技术的几位先驱创办的公司所开发。
那么这些企业所开发的体内基因编辑疗法进展如何呢？
从时间上来看，全球首个进入临床阶段的体内基因编辑疗法是由Sangamo所开发的SB-913，用于治疗II型黏多糖贮积症，但最终因临床效果不佳而停止开发。后续进入临床的有Edita Medicine的EDIT-101、Intellia Therapeutics的NTLA-2001。
从适应症和作用机制来看，NTLA-2001用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性，患者的转甲状腺素蛋白（TTR）基因发生突变，导致肝脏中产生错误折叠的转甲状腺素蛋白，能引起心脏、神经、消化系统等多组织的受累。
NTLA-2001由脂质纳米颗粒（LNP）通过静脉注射递送到患者血液中，LNP内有编码CRISPR基因编辑器组件的mRNA，利用mRNA表达的瞬时性可以增加基因编辑的安全性。NTLA-2001在体内敲除突变的转甲状腺素蛋白基因可以降低体内错误折叠的转甲状腺素蛋白的水平。
NTLA-2001构成和作用机制（来源：NEJM）
EDIT-101是一款为眼部疾病Leber先天性黑蒙10型研发的基因编辑疗法。这是一种由CEP290缺陷引起的视网膜感光细胞或附近细胞遗传缺陷疾病，CEP290基因编码蛋白来辅助其它蛋白在感光细胞周围穿梭。
EDIT-101使用AAV5携带编码两种gRNA和SaCas9的基因拷贝，通过视网膜下注射给药，作用于视网膜中有存活感光器的部分，基因编辑器通过剪切CEP290中的一个常见突变，使其产生功能性蛋白。
EDIT-101构成和作用机制（来源：Editas）
因为眼睛是一个具有“免疫豁免”特性的器官，可以耐受外源抗原而不产生炎症免疫反应，而且眼睛相对封闭，较为安全，目前有许多眼部疾病的基因疗法和基因编辑疗法正在开发。
从临床数据来看，Intellia率先在今年6月公布了NTLA-2001的I期临床的初步结果。在NTLA-2001静脉给药28天后，低剂量组转甲状腺素蛋白水平平均降低了52%，高剂量组转甲状腺素蛋白水平平均降低了87%。而且在给药28天后，并没有出现严重不良事件，也没有NTLA-2001剂量相关的脱靶事件发生。
值得一提的是，NTLA-2001还在今年10月获得了FDA授予的孤儿药称号。
再来看EDIT-101，它的I/II期临床试验结果在今年9月公布，在2例接受中等剂量治疗的成人患者中观察到了支持临床获益的疗效信号，截至这项结果公布时未观察到严重的不良事件或剂量限制性毒性。
NTLA-2001和EDIT-101都将继续进行高剂量药物的研究。
最后再来看一下两家公司体内基因编辑疗法的布局情况。
Intellia在10月份不仅宣布了与SparingVision的眼部疾病基因编辑疗法的合作，而且公司的第二款体内基因编辑疗法NTLA-2002的I/II期临床试验已获新西兰药品和医疗器械安全局批准，用于治疗遗传性血管性水肿。
同样在10月，Intellia在欧洲基因和细胞治疗学会（ESGCT）会议上公布了另一款治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的体内基因编辑疗法NTLA-3001的非人类灵长类动物数据，这一疗法能持续产生正常人类水平的功能性α-1抗胰蛋白酶，还能减少疾病相关蛋白的表达。
Intellia的体内基因编辑疗法管线（来源：Intellia）
Editas的体内基因编辑疗法数目没有Intellia多，且主要围绕在眼部疾病，在神经系统疾病上的开发还处于非常早期的阶段。
Editas的体内基因编辑疗法管线（来源：Editas）
在国外，除了Intellia和Editas，开发体内基因编辑疗法的还有LogicBio Therapeutics、Excision BioTherapeutics、Beam Therapeutics等，除了Excision的EBT-101项目获批临床，其它项目都处于临床前研发阶段。在国内，开发体内基因编辑疗法进展最快的是本导基因，治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的BD111目前进入了临床阶段。
总的来说，Intellia目前处于体内基因编辑疗法开发的最前端且优势较大，整个体内基因编辑疗法赛道所覆盖的适应症领域中。目前，肝脏疾病和眼部疾病进展较快，神经系统疾病、传染病以及癌症等也正在积极探索中。
体内基因编辑疗法的进步代表着未来基因编辑技术更广阔的应用空间，每一阶段的成功背后是基因编辑技术所走过的每一段不易的研发路，也值得我们去期待未来更多的进步。
专家点评
本导基因创始人 蔡宇伽博士
蔡宇伽博士，上海交通大学系统生物医学研究院研究员。长期从事基因治疗病毒载体、基因编辑递送技术的研发以及基因治疗载体与机体免疫系统互作的研究，致力于新技术的临床转化。开发了慢病毒蛋白转导以及mRNA转导的PCT国际专利技术。领导了世界首个基于mRNA递送系统的体内基因编辑治疗的临床研究。
体内基因编辑优势
首先，体内基因编辑在适应症的选择上更具多样性和灵活性，几乎可以覆盖所有病种。体内基因编辑无需细胞分离，摆脱了体外培养的条件束缚，因而理论上可以选择任何细胞或组织来进行编辑。其次，体内基因编辑药物是通用型药物，非个体化药物。终产品对应的是纳米颗粒或者病毒载体，而非细胞，从而大幅度减少生产成本，在未来市场上提供患者用得起的基因治疗药物。
技术突破的关键
体内基因编辑对载体技术和工艺水平等关键环节有更高的要求。特别是载体技术，需要同时满足安全性与有效性，这需要科学上的底层创新。目前来看，VLP与LNP可以实现mRNA的体内递送，并且经过了临床验证，是较为理想的体内基因编辑治疗递送载体。未来，需要进一步解决载体的组织靶向性问题。
提高安全性的方向
体内基因编辑疗法的安全性提升一是从酶入手，开发更加精准的基因编辑酶工具；二是从递送技术入手，实现组织特异的基因编辑酶递送以及瞬时性的递送。总的来说，提高安全性的核心就是要减少脱靶风险和免疫反应风险。
本导基因的技术特色
本导基因团队为了解决体内基因编辑的安全性和有效性的挑战，开发了VLP-mRNA递送技术。通过VLP递送Cas9 mRNA可以实现瞬时性但又非常高效的体内基因编辑。另外，通过修饰VLP的表面蛋白，我们可以让VLP靶向任何我们感兴趣的细胞和组织。
在管线布局的策略上，我们首先选择从病毒性疾病入手。因为该类疾病通过编辑病毒的基因即可实现治疗效果，不需要改变任何人的基因，这可以降低早期体内基因编辑在安全性上的不确定性风险。例如，我们第一个适应症是病毒性角膜炎，这是一种由HSV-1病毒感染引起的致盲性疾病。通过病毒性角膜炎的临床研究，我们初步证明了VLP递送CRISPR的安全性和有效性。在此基础上，我们布局了其他感染性疾病以及包括神经系统疾病在内的非感染性疾病。
未来展望
长远来看，体内基因编辑使得HBV、HPV、HIV、HSV等病毒感染的治愈成为可能。此外，体内基因编辑治疗代谢类疾病、神经系统疾病取得临床突破的可能性非常大，像亨廷顿舞蹈症这样长期以来没有实质性突破的疾病有可能通过体内基因编辑被治愈。
参考资料：
[1] Gillmore J.D., Gane E., Taubel J., etal. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med (2021)
[2] https://ir.intelliatx.com/press-releases
[3] Editas Medicine Announces Positive Initial Clinical Data From Ongoing Phase 1/2 BRILLIANCE Clinical Trial Of EDIT-101 For LCA10（来源：Editas）
[4] Excision Receives FDA Clearance of IND for Phase 1/2 Trial of EBT-101 CRISPR-Based Therapeutic for Treatment of HIV（来源：GlobeNewswire）
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