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基于嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的免疫疗法是一种新型肿瘤治疗方法，对某些血液肿瘤具有显著的疗效【1】。嵌合抗原受体（CAR） 是指利用细胞工程手段，在T 细胞表面表达抗原受体，通过结合特定肿瘤抗原激活T细胞，实现对肿瘤的特异性免疫治疗。CAR-T 细胞免疫疗法在针对CD19+ B细胞恶性肿瘤的治疗中取得了显著疗效，已被美国FDA和欧洲药品管理局批准用于治疗特定适应症。2021年6月，国家药品监督管理局批准了首款CAR-T细胞治疗产品国内上市，用于复发难治性大B细胞淋巴瘤成人患者。9月，国家药品监督管理局又批准了另一款新的CAR-T细胞治疗产品在国内上市。然而，由于缺乏对活性T 细胞定量、定位及定时的精准操控技术，CAR-T 细胞免疫疗法的安全性仍是临床上亟需解决的问题之一【2】。在接受CAR-T 细胞免疫疗法的患者中，有超半数以上可能经历致命的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）和神经毒性，或者对健康细胞存在“在靶/脱肿瘤”（on-target, off-tumor）的细胞毒性，从而导致B 细胞发育不全。因此，开发能够对CAR-T细胞在时间和空间上精准操控的方法，对于实现安全精准的细胞免疫治疗至关重要。
图：LiCAR-T细胞免疫疗法概念图
2021年10月25日，德州农工大学周育斌教授团队与 University of Massachusetts Medical School韩纲教授团队及Texas A&M University黄韵教授团队合作（文章的共同第一作者为Nhung Nguyen博士和黄凯博士），在Nature Nanotechnology发表题为Nano-optogenetic engineering of CAR T-cells for precision immunotherapy with enhanced safety的研究论文，报道了利用纳米光遗传学技术远程体外操控CAR-T细胞实现安全精准的细胞免疫疗法。该研究对CAR-T 细胞进行优化设计，获得了对蓝光或者近红外光响应的 CAR-T 细胞 (命名为LiCAR-T) 。LiCAR-T细胞与肿瘤抗原结合后，能够在深组织穿透的红外光的激活下，实现对肿瘤免疫反应的时空精准操控，从而实现了安全精准的细胞免疫疗法。
研究人员利用已被 FDA 批准的抗 CD19 CAR-T 细胞免疫疗法为例，针对CD19阳性的肿瘤细胞，对T细胞进行工程设计，引入光控组件。同时，为了证明纳米光遗传学技术无线操控体内细胞免疫疗法的可行性，研究人员进一步将 LiCAR-T 与高效上转换纳米颗粒结合，实现近红外光对免疫反应的远程无线操控。利用上转换纳米材料作为光传感器，可将组织穿透能力强的近红外光转换成蓝光，进而原位激活LiCAR-T 细胞，实现了对细胞免疫疗法的时空精准操控，从而避免了当前免疫疗法的相关副作用，大大提高了免疫疗法的安全性。
图：LiCAR-T细胞肿瘤免疫治疗示意图
研究伊始，为了实现对T细胞的光控激活，研究人员通过工程手段将嵌合抗原受体功能区块拆分成两个模块，并在两个模块上分别安装光控组件，即燕麦来源的 light-oxygen-voltage domain 2 (LOV2)-ssrA/sspB光控二元异聚组件。光控组件能够在蓝光激发下，将两个模块合并成一个完整的功能性嵌合抗原受体，恢复T细胞的活性。为了实时追踪两个模块在细胞内的表达，研究人员分布在两个模块上标记了荧光蛋白，模块1上标记的是GFP、模块2上标记的是mCherry。随后，研究人员通过细胞荧光成像发现，虽然两个模块都能在细胞内成功表达，然而模块1并不能集中表达在细胞膜上，并且模块2倾向于集中在细胞核附近。这不利于实现对T细胞的高效激活。
图：第一代LiCAR工具（左）和第二代LiCAR工具（右）
为了提高模块1在细胞膜上的特异性表达，研究人员在模块1中插入内质网输运信使肽，以增强其对细胞膜的靶向性。同时，为了减小模块2在细胞核区域的聚集，研究人员在模块2中插入细胞核输出信使。通过这两种优化手段，研究人员开发出第二代LiCAR工具。利用荧光成像，研究人员证实模块1对细胞膜的靶向性显著增强，并且模块2显著减小了在细胞核区域的聚集。在此基础上，研究人员进一步对模块2进行了优化，增强了其与模块1的光照合并性能。
图：第三代LiCAR-T细胞具有显著降低的暗活性
然而，研究人员在检验LiCAR工具对T细胞的光特异性激活效果时发现，第二代LiCAR工具虽然能够在光照条件下高效激活T细胞，但是仍然具有较为明显的暗活性，即在未接受光照的条件下T细胞仍然激活。而T细胞的暗活性有可能加剧细胞因子释放综合征及“在靶/脱肿瘤”细胞毒性等副作用。为了解决这一问题，研究人员进一步对第二代LiCAR工具中模块2的光控组件sspB进行工程化改造，获得第三代LiCAR工具。相比于第二代LiCAR工具，第三代LiCAR工具的暗活性显著降低，并且仍然保持了较高的光激活活性。
图：LiCAR-T细胞在肿瘤抗原和光照的双重激活下对肿瘤细胞的特异性杀伤
在获得了具有良好光特异性激活的LiCAR-T细胞后，研究人员首先在体外条件下验证了LiCAR-T细胞对肿瘤细胞的光激活免疫杀伤。研究人员以人源外周血单核细胞 (PBMC) 的 CD8+ T 细胞为基础，设计表达了具有光控组件的LiCAR-T细胞。研究发现，在无蓝光照射的条件下，LiCAR-T细胞并未被激活；而LiCAR-T细胞在蓝光的照射下，表现出与传统CAR-T细胞对特异抗原表达的肿瘤细胞相当的杀伤效果。而对于无特异抗原表达的肿瘤细胞，无论光照与否，LiCAR-T细胞均未被激活。这些结果证实，LiCAR-T 细胞能够在肿瘤抗原和光照的双重刺激下，特异、且严格的杀伤肿瘤细胞。
图：LiCAR-T细胞实现对CD19+肿瘤的特异、可精准操控的细胞免疫治疗。（上）LiCAR-T细胞用于对CD19+肿瘤免疫治疗的示意图；（中）LiCAR-T细胞免疫治疗对CD19+肿瘤的特异性；（下）近红外光对LiCAR-T细胞免疫治疗的无线精准操控。
为了实现使用LiCAR-T细胞治疗深组织肿瘤的目的，研究人员创造性地将LiCAR-T细胞与上转换纳米颗粒结合起来，利用上转换纳米颗粒将红外激发光转换为蓝光，原位激活LiCAR-T细胞，从而解决了传统光遗传学工具受制于组织穿透深度浅的可见光激发的缺点，并实现了无线操控的纳米光遗传学技术。研究人员首先构建了CD19+ B16-OVA-hCD19和CD19- B16-OVA小鼠肿瘤模型。待肿瘤形成后，分别在肿瘤部位，注射上转换纳米颗粒和LiCAR-T细胞。为了提高上转换纳米颗粒的发光性能，研究人员合成了高浓度Yb3+掺杂的大尺寸NaYbF4:0.5%Tm@NaYF4上转换纳米盘（底部直径约200 nm，高度约85 nm）。通过提高Yb3+的掺杂浓度及增加纳米颗粒尺寸，使得上转换纳米盘的发光强度相对于传统的30 nm粒径的NaYF4:30%Yb,0.5%Tm@NaYF4纳米颗粒，提高了约4.5倍。在980 nm波长的近红外光照射下，该上转换纳米盘发出蓝光，原位激活LiCAR-T细胞，对小鼠CD19+肿瘤细胞具有高效的杀伤效果；而在无光照或CD19-的条件下，LiCAR-T细胞不具有肿瘤杀伤效果。在肿瘤瘤原位注射LiCAR-T细胞的基础上，研究人员还进行了静脉注射LiCAR-T细胞，配合瘤内注射或与LiCAR-T细胞共注射的上转换纳米颗粒，利用近红外光可控激活免疫反应，同样实现了对小鼠肿瘤的有效抑制。
图：LiCAR-T细胞免疫疗法能够有效避免细胞因子释放综合征等副作用
随后，研究人员验证了LiCAR-T细胞能够有效避免传统CAR-T细胞免疫治疗的副作用。特别针对“在靶/脱肿瘤” （“on-target, off-tumor”）细胞毒性及细胞因子释放综合征（CRS），研究人员通过对比LiCAR-T细胞和常规T细胞对小鼠B细胞发育的影响及对小鼠体内细胞因子水平的影响，证实了LiCAR-T细胞能够实现更加安全可控的细胞免疫疗法。
值得一提的是，该合作团队深耕纳米光遗传学技术，近年来在该领域取得了一系列研究进展。其中，2015年，该合作团队将上转换纳米颗粒结合到树突状细胞表面，利用上转换纳米颗粒将红外光转换为蓝光，原位激活树突状细胞膜上的钙离子通道，对树突状细胞引起的免疫反应实现了无线操控【3】。此外，该合作团队还利用上转换纳米颗粒介导的纳米光遗传技术对细胞坏死性凋亡和细胞焦亡进行无线操控，用于治疗肿瘤（详见BioArt报道：Adv Sci | 新型合成生物学工具实现用光遥控细胞焦亡和坏死性凋亡）【4】。同时，该合作团队还开发了利用纳米光遗传学技术无线操控光敏蛋白实现对肿瘤的可控免疫治疗（详见BioArt报道：Nat Chem Biol | 新型光遗传学工具cpLOV2助力远程基因工程控制和精准细胞免疫疗法）【5】。
综上，该研究巧妙的利用纳米光遗产学技术时空操控LiCAR-T细胞活性，从而助力精准操控的细胞免疫疗法。同时，与上转换纳米颗粒结合使用，利用近红外光实现对深组织免疫反应的无线操控，能够克服传统光遗传学技术组织穿透能力差的缺点。上述LiCAR-T细胞能够有效避免传统CAR-T细胞免疫疗法中“在靶/脱肿瘤”细胞毒性及CRS等毒副作用，显著提高了细胞免疫疗法的安全性。这种可远程控制的纳米光遗传学技术将不仅为研究嵌合抗原介导的抗肿瘤免疫提供独特的研究手段，还为开发智能免疫疗法和提供个性化抗癌治疗奠定了临床转化基础。
Yun Huang课题组（https://ibt.tamu.edu/faculty/yun-nancy-huang.html）和Yubin Zhou研究组（https://yubinzhou.webs.com/）一直致力于表观遗传学、血液系统肿瘤发生、心脏发育、合成生物学、生物医学工程和光控遗传学的前沿研究。其团队在Nature及多个子刊系列杂志，Science Advances, Cell Chemical Biology, Advanced Science, 以及JACS, Angewandte Chemie, Chemical Science等顶级化学期刊发表多篇封面文章，并为Physiological Reviews, Trends series, 和Current Opinion系列杂志撰写领域内权威综述文章。课题组从事基础以及转化医学研究，已培养出独立PI若干名。课题组长期招聘博士研究生及博士后，欢迎志同道合的科研爱好者加盟或来函咨询。
简历投递（有意者请将个人简历等材料发至）：
https://jinshuju.net/f/ZqXwZt
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41565-021-00982-5
制版人：十一
参考文献
1. June, C.H. et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science 2018, 359, 1361-1365.
2. Tan, P. et al. Optogenetic Immunomodulation: Shedding Light on Antitumor Immunity. Trends Biotechnol 2017 (35), 215-226.
3. He, L. et al. Near-infrared photoactivatable control of Ca(2+) signaling and optogenetic immunomodulation. eLife 2015 (4): e10024.
4. He, L. et al. Optogenetic Control of Non-Apoptotic Cell Death. Advanced Science 2021: 2100424.
5. He, L. et al. Circularly permuted LOV2 as a modular domain for optogenetic engineering. Nature Chemical Biology 2021,17(8):915-23.
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