来源 | Mol Plant植物科学
撰文 | SCI Shi
资源方法与技术速报
2021年10月11日，Plant Physiology在线发表了英国东安格利亚大学Hiroaki Adachi团队题为“A vector system for fast-forward studies of the HOPZ-ACTIVATED RESISTANCE1 (ZAR1) resistosome in the model plant Nicotiana benthamiana”的方法论文。该研究以AtZAR1及其烟草同源蛋白NbZAR1为基础，建立了一套含72个Golden Gate质粒的载体工具pZA，并证实了它们可以在烟草中进行ZAR1介导的免疫蛋白研究。
烟草（Nicotiana benthamiana）是研究植物生物学的一种模式植物，特别是植物免疫方面。利用农杆菌渗入法可以在烟草叶片中瞬时表达蛋白的特性，烟草充当了细胞生物学、生物化学、蛋白质互作等研究的体内实验载体。另外，同样作为开花植物，烟草和拟南芥的亲缘关系不近；烟草中的实验结果作为对拟南芥相关研究的补充的同时，也预示了相关机制在双子叶植物中具有一定的保守性。
NLRs（nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins）是一类细胞内免疫受体，可以识别病原体效应蛋白并诱导超敏性细胞死亡（hypersensitive cell death）。拟南芥ZAR1 (HOPZ-ACTIVATED RESISTANCE1)复合体是首个完成结构解析的NLR蛋白，活化的ZAR1可以形成五聚复合物――抗病小体（resistosome）。NLRs的N端具有非常高的保守性，前期研究表明ZAR1的N端在抗病小体中形成了一个作为钙离子通道的孔状结构。
图1. ZAR1和 XopJ4在烟草中诱导细胞死亡
为了能够在植物体内快速地进行免疫蛋白复合体研究，该研究决定建立一套可以在烟草中表达的载体工具。作者分析了ZAR1蛋白在双子叶植物中的保守性，并确立了烟草的同源蛋白NbZAR1。Golden Gate是一个高效的分子克隆系统，它可以通过多个模块（如启动子、终止子、报告基因等）的拼装构建各种质粒。该研究首先分别构建了AtZAR1、NbZAR1和NbZAR1syn（合成型NbZAR1，用来规避RNAi引起的基因沉默）的野生型，活化型及突变型初级载体（Level 0）; 然后将这些ZAR1基因再拼装到含或不含C末端标记（有4xMyc, 6xHA和 eGFP）的植物表达载体（Level 2）。同时，为了在烟草中激活ZAR1，作者也构建了NbZAR1互作蛋白NbJIM2及黄单胞菌（Xanthomonas perforans）效应蛋白XopJ4的表达载体。最后，该研究经过一系列的实验证实了这套载体工具可以在烟草中进行ZAR1介导的抗病小体研究。
结论
总而言之，该研究在烟草中建立了一套以ZAR1为基础的含72个Golden Gate质粒的载体工具pZA，为在植物体内进行抗病小体的研究提供了额外的实验体系。鉴于ZAR1同源蛋白广泛存在于植物中， pZA有助于快速地进行ZAR1同源蛋白的抗病小体研究，并有望解答抗病小体作为触发 NLR 介导的免疫机制是如何进化的。
主要参考文献
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论文链接：
https://doi.org/10.1093/plphys/kiab471