慢性肾病（Chronic kidney disease, CDK）严重威胁了人类的生命健康，表现为尿液及相关血液指标，肾脏病理学与影像学检查异常，持续时间超过3个月，或肾小球有效滤过率低于60%，都可统称为慢性肾病。目前，市场用于延缓慢性肾病的药物主要有血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEi），血管紧张素受体阻断剂（Angiotensin receptor blockers, ARB），2型钠-葡萄糖协同转运蛋白抑制剂（Sodium-glucose cotransporter-2, SGLT2i）等，但仍有很多慢性肾病不受控制，进而发展到终末期肾病（End stage renal disease, ESRD）。因此，慢性肾病治疗仍需要特异性的新靶标和First-in-class药物。
胆固醇沉积作为慢性肾病（糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD），局灶节段性肾小球硬化（Focal segmental glomerulosclerosis, FSGS），Alport综合征（Alport syndrome, AS）等）的典型代谢特征，大多来自于外排转运的异常调控。胆固醇的逆向转运是肝外组织代谢胆固醇的主要途径，需要胆固醇外排的细胞表面存在ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1），介导胆固醇等脂类的向外运输，进而载脂蛋白（apolipoprotein）apoAI，apoAII结合胆固醇组装成高密度脂蛋白（ high-density lipoprotein，HDL）随血液循环运送至肝。
为了获得逆转胆固醇沉积这一病理特征，近来Roche公司的研究人员进行相应的药物研发。他们首先开发了一种检测胆固醇外流的表型筛选方法，给胆固醇进行放射性标记，加入化合物和必要的载脂蛋白来诱导胆固醇外流，通过放射性计数来评价化合物活性，通过该表型筛选获得了一类5-芳基烟酰胺化合物。进一步，他们在Tangier病人（ABCA1基因突变或缺失）的成纤维细胞内进行了胆固醇外流实验，进一步证明了5-芳基烟酰胺类化合物介导胆固醇外流的作用是ABCA1依赖性的，且以非转录机制上调ABCA1表达（LXR激动剂T1317作为阳性分子对照，其参与对ABCA1的转录调控作用，上调ABCA1蛋白表达）。
为了获得这类化合物作用机制，研究人员对5-芳基烟酰胺类化合物介导胆固醇外流的靶标进行了筛选和验证。有趣的是，这类化合物曾被报道过是大麻素受体的拮抗剂。首先，研究人员在这类化合物（compound H）基础上合成了具有光活化功能的的氚标记的叠氮化物衍生物compound K（cpdk）。利用cpdk作探针，结合化合物捕获质谱技术（Compound capture mass spectrometry, CC-MS），他们筛选出了若干与cpdk有亲和力的蛋白，并挑选了其中可能参与ABCA1途径的蛋白。进而，通过构建在C端融合有FLAG标签的候选蛋白的表达质粒，转染HEK293细胞，加入cpdk孵育，用抗flag抗体对候选蛋白进行免疫亲和纯化，Western Blot检测和放射自显影，共筛选出8个候选蛋白。排除可能存在的非特异性结合后，研究人员通过竞争结合实验最终确定了氧甾醇结合蛋白相关蛋白7（Oxysterol binding protein-related protein 7，OSBPL7）和大麻素受体1（cannabinoid receptor type 1，CNR1/CB1R）是这类化合物的潜在结合靶标。
进一步，研究人员通过胆固醇外流实验和竞争结合实验发现（对比大麻素受体拮抗剂rimonabant），OSBPL7 结合与 ABCA1 活性上调正相关，提示5芳基烟酰胺类化合物在介导ABCA1依赖性胆固醇外流这一过程的药理学靶点是OSBPL7，而不是大麻素受体CB1R。
为了验证这一结论，他们用了其他CB1R的拮抗剂和激动剂，发现在胆固醇外流中都没有活性。用siRNA分别敲低OSBPL7和CB1R，验证敲低效率可行后，进行功能实验。结果发现敲低OSBPL7显着刺激胆固醇流出，而敲低CB1R后胆固醇流出没有明显差异，且敲低CB1R对compound G介导胆固醇外流的活性没有影响。这些证据验证了尽管5-芳基烟酰胺类化合物结合CB1R，但CB1R并不影响其对胆固醇外流的活性，在此过程中发挥药理学作用的靶点是OSBPL7。
通过同源建模和分子对接等方法，研究人员预测了这类化合物与OSBPL7的结合位点。化合物可能结合于OSBPL7 C端的一个高度保守的氧甾醇调节结构域（Oxysterol regulatory domain，ORD）。他们对ORD的一些关键氨基酸进行了点突变，评估放射性标记的compound K结合野生型和突变型OSBPL7的亲和力差异，其中Ile641、Val616、Val618 和Lys636的突变均使化合物结合亲和力下降，而这些氨基酸正好是氧甾醇结合蛋白相关蛋白家族ORD中高度保守的氨基酸残基，提示5-芳基烟酰胺类化合物可能结合在OSBPL7的ORD区域。
在功能方面，他们研究了代表性化合物compound A（cpdA），compound G（cpdG）对人源肾足细胞中ABCA1 表达和胆固醇流出的影响，都表现出促进作用。在药物处理后，cpdA和cpdG都增加了质膜上的 ABCA1表达，但与 LXR 激动剂不同的是，它们没有增加微粒体部分中的 ABCA1表达，表明 cpd A 和 cpd G 可以稳定质膜上的 ABCA1。他们用WB和免疫荧光染色证实OSBPL7在肾和其他部位均有表达，提示靶向OSBPL7治疗慢性肾病的可行性。
最后，研究人员用两种小鼠肾病模型来评估cpdA和cpdG的治疗潜力。阿霉素 (Adriamycin, ADR) 诱导的肾病模型是局灶节段性肾小球硬化 (Focal segmental glomerulosclerosis, FSGS) 最常见的实验模型。在这种模型下，cpdA和cpdG均显著减小了疾病小鼠的尿白蛋白肌酐比值，并减少了由肾病引起的体重下降（cpd G功效更明显），缓解了肾小管囊肿和间质炎症。在敲除IV型胶原基因小鼠诱导的Alport综合征疾病模型中，通过尿白蛋白，血清肌酐，血尿素氮，体重等指标发现cpdG可明显延缓肾病的恶化。死亡率分析表明，cpdG对晚期肾衰竭有治疗效果。并且cpdG减少了两种疾病模型中肾皮质中胆固醇酯的沉积，说明cpdG在慢性肾病治疗中具有一定的应用潜能。
综上，本文以临床问题为导向，针对部分肾病的病理特征-胆固醇沉积开发了表型筛选方法，筛选出一类5芳基烟酰胺化合物，进行靶点筛选和验证，预测结合位点，并通过体外/体内实验证明活性化合物在肾病治疗中的应用潜力。但仍然有很多不足之处和尚未解决的问题：首先，实验证据显示活性化合物以非转录机制提高了ABCA1蛋白表达量，但没有解释原因；其次，活性化合物靶向OSBPL7的作用机制（比如抑制还是激活），以及如何通过OSBPL7影响胆固醇外流？OSBPL7和ABCA1存在什么关系？第三，靶点筛选中是否有遗漏？是否会有化合物脱靶效应？另外，相比LXR激动剂有何优劣之处？是否存在和LXR激动剂类似的副作用？总而言之，研究人员筛选出一类在肾病治疗中有应用潜力的5-芳基烟酰胺化合物，但其作用靶点和发挥药理学作用的机制没有阐述清楚，还需要更多研究去探讨这类化合物的作用。
参考文献
1. Wright MB, Varona Santos J, Kemmer C, et al. Compounds targeting OSBPL7 increase ABCA1-dependent cholesterol efflux preserving kidney function in two models of kidney disease. Nat Commun. 2021;12(1):4662.
2. Röver, Stephan et al. 6-Alkoxy-5-aryl-3-pyridinecarboxamides, a new series of bioavailable cannabinoid receptor type 1 (CB1) antagonists including peripherally selective compounds. Journal of medicinal chemistry vol. 56,24 (2013): 9874-96.
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