随着新冠病毒（SARS-CoV-2）在全球广泛传播，新冠病毒变体不断出现【1, 2】。这其中的不少变体不仅拥有更强的传播力和致病性，往往还能在新冠疫苗免疫人群中突破感染，对当前新冠防控提出了巨大挑战【2】。鉴定新冠病毒广谱保护性表位、创制广谱免疫保护疫苗及药物迫在眉睫。
与SARS-CoV类似，SARS-CoV-2使用ACE2作为启动感染的细胞受体【3】。在感染过程中，SARS-CoV-2的S蛋白首先被裂解S1和S2亚基；S1亚基的RBD先与ACE2结合，然后S2亚基介导病毒与细胞膜的融合【3】。其中，S1亚基抗原突变频繁；S2亚基则较为保守，是极具吸引力的广谱免疫保护靶标【4】。然而，目前S2亚基中的保护性表位尚未被广泛研究【5, 6】。
鉴此，2021年10月13日，扬州大学兽医学院秦爱建/叶建强团队联合中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高团队，中国农业大学动物医学院刘平黄团队以及陆军军医大学全军免疫学研究所叶丽林团队等合作在Cellular & Molecular Immunology杂志上发表文章A novel linear and broadly neutralizing peptide in the SARS-CoV-2 S2 protein for universal vaccine development，利用基于合成肽的ELISA技术，发现一个源于S2亚基的P4多肽（S蛋白的1139-1170位氨基酸）与新冠康复病人的血清具有良好的反应性，表明P4多肽携带功能性B细胞抗原表位（图1a）。进一步序列比对发现，P4位于七肽重复序列1（HR1）和七肽重复序列2（HR2）的连接区域，且P4的序列在SARS-CoV、BatCoV RaTG13、SARS-CoV-2以及新近出现的SARS-CoV-2变体（包括B.1.1.7、B.1.1.298、B.1.429、P.2、P.1、B.1.351和B.1.617.2）中均高度保守（图1b和c）。
HR1和HR2在冠状病毒的膜融合过程中扮演着重要角色[7]，故而推测P4是开发基于肽的抑制剂和疫苗的潜在靶点。为了验证该猜想，用KLH-P4偶联多肽免疫小鼠，并获得了4株抗P4多肽的单克隆抗体：B10、C10、E2和G5。通过假病毒中和试验发现，单抗B10、C10和G5均能有效中和SARS-CoV-2 S蛋白假病毒，而单抗E2则不能中和该假病毒（图1d）。此外，单抗B10、C10和G5还能有效中和SARS-CoV S蛋白假病毒（图1e）。值得注意的是，单抗G5亦可有效中和含新冠南非株B.1.351 S蛋白的假病毒（图1f）。与上述数据一致，单抗B10、C10和G5能中和在Vero E6细胞上野生型新冠病毒SARS-CoV-2的感染（图1g）。同时，单抗B10、C10和G5均能有效阻抑rVSV-SARS-CoV2-S-GFP嵌合病毒在Vero E6细胞中的扩散，而单抗E2则不能（图1h）。
图1 一种源于SARS-CoV-2 S2蛋白的新型广谱保护性多肽P4的发现及鉴定
通过构建S2-P4系列截短体和Western blot试验证明，单抗B10、C10、E2和G5均可有效识别SARS-CoV-2和SARS-CoV的S和S2蛋白（图2a和b），且发现序列1155YFKNHTSP1162为这些单抗所识别抗原表位的关键结合位点（图2c和d）。另外，通过免疫沉淀试验发现单抗B10、C10和G5与S2蛋白的亲和力远高于单抗E2。
图2 抗P4单克隆抗体B10、C10、E2和G5识别表位的鉴定
为了评价P4是否具有新冠疫苗研发价值，构建了P4三聚体表达载体3×P4，并进行蛋白表达及纯化（图3a和b）。Western blot结果证实该三聚体蛋白能被单抗G5所识别，表明重组蛋白具有较好的免疫原性（图3c）。用P4三聚体蛋白免疫小鼠制得多抗血清进行假病毒中和试验发现，该多抗能有效中和SARS-CoV-2 S蛋白假病毒，并呈剂量依赖性（图3d）。
图3 P4三聚体蛋白有效诱导小鼠产生抗SARS-CoV-2中和抗体
随后为探究抗P4单抗抑制新冠病毒入侵的机理，进行了S蛋白介导的细胞-细胞融合抑制试验。结果发现单抗G5能有效抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞间融合，且呈剂量依赖性，而单抗E2及对照抗体均不能抑制该细胞融合（图4a）。因此，针对P4的抗体可能通过阻断病毒和宿主细胞膜的融合来抑制病毒进入宿主细胞（图4b）。
图4 抗P4抗体抑制SARS-CoV-2感染宿主细胞的机制探究
总之，该研究发现了一种源于SARS-CoV-2 S2蛋白的新型广谱线性保护性多肽，与其他交叉中和表位不同【4-9】，其在SARS-CoV、BatCoV-RaTG13、SARS-CoV-2和SARS-CoV-2变体中均高度保守。鉴于当前SARS-CoV-2变体及其免疫逃逸株的不断出现，诸如该研究中的P4广谱保护性多肽的鉴定及对应中和单抗G5等的研制，为开发通用新冠疫苗和治疗药物提供了契机。据悉，研究者目前正在检测G5单链抗体抗新冠病毒效果以及大量表达P4三聚体蛋白，拟开展相关的动物体内试验研究。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41423-021-00778-6
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