以免疫检查点抑制剂为代表的癌症免疫疗法给癌症治疗带来了革命性的转变，然而目前检查点抑制剂的一个主要挑战是很多患者仍然无法从中获益。有些类型的癌症（比如胶质母细胞瘤和胰腺癌）可能因为肿瘤本身免疫原性不高而不能产生应答。然而即使在免疫检查点表现出疗效的癌症类型中（比如黑色素瘤），有力而持久的缓解也只在一部分患者中出现，而且患者在最初获得缓解之后，随着时间的推移会对疗法产生耐药性。
近日，顶尖学术期刊《细胞》发表了一篇深度综述，对影响检查点抑制剂疗效、耐药性、以及毒副作用的因素进行了全面盘点，并且探讨了改进疗效和降低毒副作用的策略。
检查点抑制剂耐药性的产生原因
耐药性产生的患者内在原因包括两大方面：肿瘤内在因素和患者全身性因素。这两个方面又包含了多种不同的因素。
1. 肿瘤内在因素
肿瘤内在因素包含肿瘤细胞本身的因素和肿瘤微环境中非肿瘤细胞的影响。
A. 肿瘤细胞内在因素
肿瘤的基因突变和表观遗传学状态是决定对检查点抑制剂应答的主要因素之一。在肿瘤发展的过程中，不断积累的突变会导致新抗原（neoantigens）和异常自体抗原的产生，这些抗原会吸引T细胞消灭肿瘤细胞，并且进一步增强检查点抑制剂引发的抗肿瘤免疫反应。因此，检测肿瘤基因组中不同突变数目的肿瘤突变负荷（TMB），已经被用来检测肿瘤的免疫原性和解释对检查点抑制剂的应答或耐药性。
不过，虽然TMB在肿瘤应答方面具有重要作用，但是有时基因突变能抑制检查点抑制剂的作用，比如导致抗原呈递异常的基因突变会促进耐药性的产生，即使TMB很高。
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此外，致癌基因信号通路和代谢通路的变化在多种癌症类型中驱动免疫原性。比如，干扰素（IFN）通过JAK激酶激活STAT信号通路，在肿瘤免疫力方面起到重要作用。PI3K激活性突变和PD-L1表达水平提高以及免疫逃逸相关。Wnt/β-catenin信号通路的激活性突变也可以改变PD-L1和PD-L2的表达，从而激发耐药性。这些研究成为将信号通路抑制剂与检查点抑制剂联用，构建组合疗法的理论基础。
新近的研究还发现肿瘤分泌的细胞外囊泡，特别是外泌体部分，对耐药性有重要影响。在动物模型中，外泌体携带的PD-L1能够抑制CD8阳性T细胞活性，并且导致T细胞耗竭。临床研究也显示，未能从检查点抑制剂治疗中获益的患者，外泌体PD-L1水平更高。
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B. 肿瘤微环境——基质细胞
肿瘤微环境包括多个非免疫细胞的基质细胞组分，比如内皮细胞、成纤维细胞和组织特异性细胞。它们在免疫逃逸机制中起到重要作用。比如，内皮细胞可以表达PD-L1，从而削弱T细胞在肿瘤微环境中的功能。在大脑转移瘤中的STAT3阳性星形胶质细胞能够抑制CD8阳性T细胞活性，并且增加CD74阳性小胶质细胞和巨噬细胞的丰度，可能促进对检查点抑制剂的耐药性。
C. 肿瘤微环境——免疫细胞
肿瘤微环境中存在着不同类型的先天或适应性免疫细胞类型。其中，CD8阳性T细胞在肿瘤边缘和内部的存在与对检查点抑制剂疗法的强力应答相关。而调节性T细胞（Treg）则释放一系列免疫抑制因子，并且表达CTLA-4和PD-1，它们削弱CD4阳性和CD8阳性T细胞的活性。
另一类具有免疫抑制活性的免疫细胞是髓源性抑制细胞（MDSCs）。它们通过精氨酸酶1、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、活性氧物种（ROS）和过氧亚硝酸盐等多种机制降低效应T细胞和自然杀伤细胞的活性。
肿瘤相关巨噬细胞 （TAMs）分为两个类型，M1型通常表达促炎症细胞因子，促进抗肿瘤免疫反应，而M2型表达抗炎症的细胞因子和趋向因子，抑制CD8阳性T细胞激活，促进Tregs的招募，与肿瘤免疫逃逸相关。
近年来的研究显示B细胞在肿瘤免疫原性和对检查点抑制剂的应答方面也有作用。B细胞在肿瘤中的存在，在黑色素瘤和肾细胞癌患者中与对新辅助免疫疗法的更好应答相关。B细胞如何影响免疫应答的机制尚未完全理解，潜在机制包括记忆B细胞通过抗原呈递激活T细胞，B细胞分泌的细胞因子和抗体也可能有抗癌作用。
▲影响检查点抑制剂应答和耐药性的多种原因（图片来源：参考资料[1]）
D. 肿瘤微环境——微生物
近年来，肿瘤内微生物对抗肿瘤免疫反应的影响得到越来越多的关注。最近的研究显示，黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤等多种癌症类型的肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞中都可能存在微生物。而且不同肿瘤类型中的微生物也不一样，意味着可能有肿瘤特异性机制介导它们的迁移。
而且，胰腺癌患者的长期生存与肿瘤微生物组的多样性和特定微生物组特征相关。在接受免疫疗法治疗的黑色素瘤患者中，应答患者和无应答患者之间的肿瘤微生物组构成也有所不同。细胞内细菌产生的多肽可以被肿瘤细胞通过人类白细胞抗原（HLA）分子呈递在细胞表面，并且被肿瘤浸润T细胞识别，这是肿瘤内微生物可能影响抗肿瘤免疫反应的一个潜在机制。
2. 患者全身性因素
已有研究显示，患者产生强力的全身性免疫反应是癌症免疫疗法成功的先决条件。影响患者全身性免疫反应的因素也是多方面的，比如HLA位点的纯合子性可能导致抗原呈递的多样性受到限制，与接受检查点抑制剂治疗患者的降低生存相关。
在临床前实验中，肠道微生物组对抗肿瘤反应的影响已经在黑色素瘤、肾细胞瘤和非小细胞肺癌模型中得到验证。而且多个研究证明，抗生素对检查点抑制剂的疗效有负面影响，可能是由于降低了肠道微生物组多样性。
而改变肠道微生物组的因素可能间接影响到抗肿瘤免疫反应。比如高纤维饮食和锻炼与肠道微生物组多样性增加，以及短链脂肪酸富集相关，这两个因素都与患者接受治疗后生存期改善相关。
目前，多个临床试验正在检验利用粪便微生物移植，改变饮食，使用益生菌等方法调节微生物组，对接受检查点抑制剂治疗的患者的影响。
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肥胖虽然通常与癌症发生和预后不良相关，但有趣的是在黑色素瘤、非小细胞肺癌和其它实体瘤中，它与接受检查点抑制剂治疗后的改善应答和生存相关，而且这个现象主要在男性患者中发生。
近年来的研究还发现，患者内在因素之外，患者与环境的相互作用也能影响癌症生物学和患者对检查点抑制剂的反应。患者与环境之间的相互作用非常复杂，并且随着时间的推移而变化，因此研究起来面对多重挑战。
目前有些环境因素的影响已经得到初步理解，比如暴露于紫外线下或者吸烟会提高肿瘤突变负荷和新抗原水平，这可能与黑色素瘤和非小细胞肺癌患者对检查点抑制剂应答更高相关。
此外，慢性压力在临床前模型中提高肿瘤生长并且阻碍抗肿瘤免疫反应和对检查点抑制剂的应答。这可能与交感神经系统活跃导致的β2受体信号通路激活相关。目前临床研究正在探索将β阻滞剂与检查点抑制剂联用的效果。
作者指出，使用多组学技术，对大量患者进行长时间的追踪研究将是理解环境因素对健康影响的关键。
影响检查点抑制剂毒副作用的因素
人体的免疫系统依靠复杂机制来保障对病原体或肿瘤产生有效免疫反应的同时对自身非肿瘤组织的耐受。而检查点抑制剂有可能打破这个平衡，导致针对自身健康组织的免疫攻击，产生相关不良反应。
免疫疗法相关的不良反应非常常见，在超过90%的患者中会出现低级别的不良反应，产生严重不良反应（3-5级）的患者比例在20%-60%之间。而且，不良反应在人类中出现的频率显著高于在小鼠模型中观察到的频率，这显示了目前临床前模型的局限性。
不良事件产生的主要原因之一是T细胞活性的异常。 肿瘤与健康组织共享的抗原可能导致T细胞激活，并且激发对非肿瘤细胞的攻击，这可能导致心肌炎和皮疹。表位扩散（epitope spread）可能增强这一反应。抗原/表位扩散指的是癌细胞死亡之后释放出新增的抗原，而这些抗原在免疫激活性微环境中可以被T细胞识别，并且导致它们被激活并攻击正常组织。
最后，在有些组织中，自身免疫T细胞可能已经存在，它们原本受到检查点分子的控制，但是在检查点抑制剂治疗的情况下被重新激活，导致毒副作用。比如，TCR分析显示，检查点抑制剂导致的结肠炎患者中大部分细胞毒性效应细胞源于本来就存在于肠道组织中的CD8阳性T细胞。
▲导致检查点抑制剂毒副作用的多种原因（图片来源：参考资料[1]）
体液免疫反应和B细胞也可能与检查点抑制剂毒副作用相关，比如外周B细胞库的早期变化与毒性相关，接近25%的黑色素瘤患者在接受检查点抑制剂治疗后出现新的自身免疫抗体。
目前，对不良反应的治疗方法通常包括停止检查点抑制剂的使用，以及使用高剂量的皮质类固醇。研究人员也在开发更具特异性的靶向治疗方案。
增强疗效和降低毒性的策略
增强检查点抑制剂应答和降低其毒性的策略包括开发预测性检测，发现能够获益的患者群体，以及增强疗效，降低毒副作用的治疗方案。
1. 使用已知和创新诊断策略预测患者应答
肿瘤突变负荷，以及微卫星不稳定性（MSI）和错位修复缺陷（dMMR）这些生物标志物预测检查点抑制剂应答的能力已经得到多个研究的支持 。FDA也已经基于这些生物标志物，批准抗PD-1抗体pembrolizumab不限癌种治疗实体瘤。不过作者指出，肿瘤突变负荷与检查点抑制剂应答之间的关系并没有在所有患者中得到证实。我们还需要更多的生物标志物来发现能够从检查点抑制剂中获益的患者群体。目前在研究中探索的免疫生物标志物包括：
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL） ：在转移性黑色素瘤患者中，基线时肿瘤内CD8阳性T细胞的水平能预测对抗PD-1疗法的有利应答。不过基线TIL的存在并不能预测对抗CTLA-4抗体的应答，这可能是因为抗CTLA-4抗体的作用机制不同。然而，在接受CTLA-4治疗后早期的TIL水平可以在黑色素瘤患者中预测有利应答。这意味着对于CTLA-4抑制剂来说，接受治疗后早期的组织活检可能提供重要的生物标志物。
免疫检查点蛋白： 治疗前肿瘤内PD-L1的表达水平在黑色素瘤和非小细胞肺癌等多种肿瘤类型中与抗PD-1和抗PD-L1抗体的应答相关。不过也有研究发现，有些没有PD-L1表达的患者也能够获得持久缓解。综述作者指出，如何定义PD-L1阳性和评估手段的差异性有可能是试验结果不一致的原因，这意味着需要对这些指标进一步标准化。
新兴策略： 单靠TIL或者PD-L1的表达并不能完全实现改善患者筛选的目标，因此，发现创新生物标志物是这一领域研发的重点之一，目前探索的创新生物标志物包括表达PD-L1的外泌体，以及肠道和肿瘤内微生物组特征。
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2. 促进疗效和克服耐药性的治疗策略
基于对检查点抑制剂耐药性产生机制的理解，研究人员目前在探索多种治疗策略，以克服耐药性并促进患者应答。其中包括：
调节表观遗传学状态：调节表观遗传学状态可能改变肿瘤免疫原性和抗体呈递。 比如，DNA甲基转移酶抑制剂能够逆转I型MHC蛋白的表观遗传学抑制，从而促进抗原呈递、免疫原性和肿瘤的免疫靶向。组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂与DNA甲基转移酶抑制剂联用，在临床前模型中也导致抗肿瘤免疫反应的增强。
信号通路调节剂 ：肿瘤信号通路的重要作用为探索基于检查点抑制剂的组合疗法提供了科学基础。一个例子是在BRAF突变黑色素瘤患者中使用抗PD-L1抗体atezolizumab和BRAF/MEK抑制剂，这一组合显著提高患者的无进展生存期。其它组合疗法的例子包括使用PI3K抑制剂或CDK4/6抑制剂。
细胞因子：细胞因子可以增加肿瘤浸润淋巴细胞的丰度，从而增强对检查点抑制剂的应答。 历史上，IL-2和IL-12都能够增强肿瘤内淋巴细胞的浸润，然而它们也同时产生严重的毒副作用。目前，多家公司在开发新一代细胞因子，旨在刺激淋巴细胞的同时降低毒副作用。
抗血管增生药物 ：抗血管增生疗法与检查点抑制剂联用，能够增强免疫细胞的肿瘤浸润并且改善患者的预后。目前，bevacizumab与PD-L1联用已经获得FDA批准一线治疗晚期肝细胞癌。这一组合也在治疗多种其它癌症类型中使用，未来有望增添适应症。
溶瘤病毒 ：溶瘤病毒不但能够杀伤病毒，而且具有刺激免疫系统，并且将非炎性肿瘤微环境转变为炎性的能力。因此目前正在多项临床试验中与检查点抑制剂联用。
癌症疫苗 ：癌症疫苗在临床前和临床研究中引发肿瘤内T细胞浸润和抗肿瘤免疫反应。它们与检查点抑制剂联用已经获得可喜的初步临床结果。
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3. 降低检查点抑制剂毒副作用的诊断和治疗策略
目前，肿瘤学家在进行检查点抑制剂治疗时需要权衡疗法的效益与毒副作用之间的利弊。这也促进了对毒副作用的预测性生物标志物的开发和对治疗方案的理性设计。
A. 毒副作用的潜在生物标志物
影响检查点抑制剂引发的毒副作用的遗传因素目前尚未得到完全澄清。研究显示特定HLA类型与之相关，这方面的研究需要横跨多种疗法和癌症类型的大规模相关性研究。
肠道微生物组的菌群失调与毒副作用相关。 比如在接受ipilimumab治疗的黑色素瘤患者中，治疗前拟杆菌（bacteroidetes）的水平，以及与维生素B生物合成和多胺运输相关遗传通路的丰度，和免疫疗法相关结肠炎相关。
外周血中免疫信号的变化因为检测相对容易，可能是具有吸引力的生物标志物。 比如，在黑色素瘤患者中，IL-17和IL-6水平的升高与毒副作用相关。对11种细胞因子的综合性评估发现全局性的细胞因子失调具有预测毒副作用的能力。
B. 降低毒副作用的治疗策略
毒副作用的创新治疗策略主要集中在替代高剂量皮质类固醇的治疗选择。 某些情况下，治疗自身免疫疾病的疗法在降低毒副作用方面表现出良好的效果。比如，TNF抑制剂在治疗炎性肠炎方面疗效出色，它们在治疗检查点抑制剂导致的结肠炎时也有很好的效果。粪便移植也在治疗检查点抑制剂导致的结肠炎时获得可喜的初步疗效。对毒副作用产生机制的进一步理解可以帮助开发更具针对性的治疗方法。
另一种预防毒副作用的策略是改善已有免疫疗法的特异性，限制它们的脱靶效应。 其中一个途径是使用双特异性和三特异性抗体来增强免疫疗法的选择性。比如募集T细胞到肿瘤细胞周围的T细胞接合器需要识别肿瘤上多个抗原才能够激活T细胞。一个例子是靶向OX40或CD137的单克隆抗体不但疗效不佳，而且可能促进肝脏毒性，然而同时OX40和CD137的双特异性抗体能促进抗癌活性，并且限制肝脏毒性。
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结语
癌症免疫疗法的出现不但改变了癌症治疗的范式，也延长了曾经治疗选择有限的患者的生命。然而由于耐药性和毒副作用，能够从中获益的患者仍然有限。可喜的是，随着对耐药性和毒副作用产生机制更为深入的了解，科学家们正在广泛探索发现能从免疫检查点抑制剂疗法中获益患者的诊断策略，以及增强疗效，降低耐药性和毒副作用的治疗策略。
综述作者指出，微生物组、患者全身性因素，以及患者与环境的相互作用在对检查点抑制剂的应答和毒性方面具有重要作用。对这些因素的更深入理解有望促进创新诊断和治疗策略的出现，克服目前疗法局限，进一步改善癌症患者的治疗结果。
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历
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文
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