打开

基因下调老无效?从方案设计到实操,教你避开实验中的「坑」

subtitle
生物学霸 2021-09-17 18:58

基因干扰技术在基因功能研究有着广泛应用,但我们自己在进行方案设计的时候,却面临着很实际的问题:选了 RNAi,担心脱靶,选了 CRISPR 又担心操作和设计太过复杂。怎样选择合适自己的方法?又怎样避开实验过程中的「坑」?是大家共同关心的问题。

丁香园联合吉凯生物,邀请到了一位基因调控方案设计的「老司机」,为大家带来「基因下调方法设计及分子克隆构建」专题讲座,价值千元的讲座课程0 元领取,手把手教你进行基因下调设计,和「隐藏 bug」说 bye bye~

扫描上方图中二维码,免费报名学习

(讲座之后,奉上基因下调无效的解决思路~)

讲座时间:9 月 22 日 15:30

讲座内容

基因下调技术(RNAi,CRISPAR-KRAB,CRISPAR-KO)及适用范围;

● 如何进行「基因分析、靶点设计、blast 比对」;

● 分子克隆全攻略:载体分析及短序列分子克隆实操;

● 基因下调研究中常见问题盘点;

以下为基因下调无效的解决思路~

目前,基因调控主要通过 RNAi 或者 Crispr/cas9 两种途径实现,这两大技术已经发展完善,应用也非常广阔,但即便如此,也没有任意一家公司能够提供 100%有效的商业化靶点。换言之,基因的 knockdown 或者 knockout 并不简单,这是为何呢?

因为靶点的有效性受限于众多因素,以 RNAi 为例,影响靶点的因素包括:

01

基因的表达水平

表达越低,敲减越难;

02

RNA的二级结构

RNA 本身是单链的,其序列某些区域可能互补,靶点就无法结合;

03

载体结构

不同骨架的载体,表达 shRNA 的水平是有差异的;

04

细胞系差异

同一个靶点,在不同细胞的敲减效率是有差异的;

那么,如何提升靶点有效性,避免无效呢?让我们看看其他科研工作者是如何解决这个问题的吧:

1

长片段基因下调

针对 mRNA、circRNA、lncRNA 这类片段普遍较长的分子,可以由原本的单靶点替换为多靶点 KD/KO,具体实验方案如下:

新思路-多靶点串联验证

Weng1等人针对红色荧光设计了三个靶点,分别构建进入 U6 启动子的载体,同时构建了一个三个靶点串联在一起的载体,并转入带有红色荧光的细胞:

打开网易新闻 查看更多图片

随后,从荧光强度、RNA 水平表达活性、WB 水平表达程度三个维度分析,发现三个靶点串联的 DsRed-3shRNA 下调基因的水平都优于三个单独的 shRNA,证实了,多靶点串联的优越性:

dsRed 是外源转入细胞并敲低的,那针对内源性基因,敲低效果如何呢?作者选择卵巢癌细胞高表达的 Akt2 作为靶标,设计单个靶点、双靶点串联、三靶点串联的三种病毒组合,分别感染细胞,结果如下:

上述针对不同基因设计靶点串联构建的形式,在动物水平应用更加广泛。

因为单只动物某一部位注射的病毒量、体积都是受限的,若要同时操作多个基因,难度更大,而多靶点串联对于基因下调则是优选,Platt3 等人使用单个 aav 病毒,运用 cas9 的方式敲除肺腺癌中前三个显着突变的基因 KRAS、p53 和 LKB1,从而建立了疾病模型:

同时敲三个基因,只需要一个病毒即可,是不是十分经济而有效呢?

2

短片段基因下调

针对 miRNA、piRNA、tsRNA 这类序列在 20bp 左右的小分子,当前下调手段主要为合成或表达其反义互补序列。以 miRNA 为例,很多研究者发现,下调后 miRNA 的 QPCR 水平却没有变化,这是怎么回事呢?

《RNA Biology》上一篇文章对于 miRNA 反义核酸的描述如下:

翻译一下:

由上我们可以得知,miRNA 反义序列只是抑制功能,并不能有效降解 miRNA,即便未检测到,正确的做法是直接检测目的基因蛋白水平是否有上调。但若实验者不清楚靶基因的情况下,没有检测到 miRNA 下调,心里便是没底的,那又如何解决呢???

答案是,反义核酸是在转录后水平发挥功能,要阻断 miRNA 的产生,理想情况是在生成成熟的 miRNA 之前阻断。此要求目前唯有 CRISPR / Cas9 能实现,Cas9 通过在 pre-miRNA 序列中引入突变,从而破坏 miRNA 表达,是 miRNA 基因功能缺失研究的一种新方法,以下案例可以帮助大家更好地理解:

(1)案例一

福建肖老师运用 Cas9 技术,针对 miR-21 基因设计 sgRNA ,通过慢病毒递送细胞,并在 RNA 水平检测到 mir-21 的下调表达,从而研究出 miR-21 耗竭对 CNE2 鼻咽癌(NPC)细胞生物学特性及其潜在机制的影响。

A.miR-21 敲除靶点;B、C. 基因组设计引物扩增 DNA 并进行 T7EN1 酶检测编辑效率;B. D.QPCR 检测成熟体表达水平

使用 Cas9 敲除 miR-21 之后,功能上也呈现出阳性:

(A-D)miR-21 敲除削弱了 CNE2 细胞的生长,侵袭和迁移能力

(2)案例二

此外,温医大第一医院的张老师使用 Cas9 敲除 mir-545,研究了人环状RNA PRKCI(circPRKCI)通过抑制 miR-545 显示致癌性,促进人类神经胶质瘤细胞的病理进展。

J. miR-545 敲除后的表达水平(Cas9-C 为对照)

所以,CRISPR / Cas9 对于 miRNA 的 KO 是有效的、被认可的、且以 QPCR 检测表达量完全没有问题。

大咖在线教学

本次课程特邀方案设计专家--陈建儒老师在线教学,6 年多的项目实操经验,贡献了多场高水平讲课直播,吸引数万听众观摩学习。陈老师将从方案设计到实操,教你避开实验中的「坑」!

与大咖面对面交流的机会不常有,9 月 22 日 15:30,锁定直播间,速来上车获取高分秘籍!

扫描下方二维码
报名领取免费讲座课程

吉凯基因作为优质病毒服务供应商,以 siRNA 合成服务起家,拥有基因操作工具品类众多(慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、HSV 病毒、质粒等)、技术手段齐全(过表达、shRNA、Crispr/cas9 等),并提供众多形式的筛靶服务,感兴趣的童鞋快来咨询设计吧!!!

内容审核:周育红、潘成

题图来源:图虫创意

文章来源:吉凯基因

参考文献:

[1] A multi-shRNA vector enhances the silencing efficiency of exogenous and endogenous genes in human cells

[2] A simple approach for multi-targeted shRNA-mediated inducible knockdowns using Sleeping Beauty vectors

[3] CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling

[4] MicroRNA-21 depletion by CRISPR/Cas9 in CNE2 nasopharyngeal cells hinders proliferation and induces apoptosis by targeting the PI3K/AKT/MOTOR signaling pathway

[5] Anti-miRNA oligonucleotides: A comprehensive guide for design

[6] Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR-21 gene editing inhibits the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells

[7] Circular RNA PRKCI promotes glioma cell progression by inhibiting microRNA-545

特别声明:本文为网易自媒体平台“网易号”作者上传并发布,仅代表该作者观点。网易仅提供信息发布平台。
帮TA点赞
大家都在看打开应用 查看全部
网易热搜每30分钟更新
打开应用 查看全部
打开