当一个分子被限制在受限空间中时，它们有时候会呈现出全新的不同于在溶液中的性质。目前，对于限域空间中分子性质的研究都集中在小分子上。对于比较大的分子例如蛋白质在单一合成主体限域空间中的研究，由于较大主体合成的困难性，还没有文献报道。仅有蛋白质在聚合物，胶束和囊泡中的研究。但是在这些体系中，聚合物和囊泡等的尺寸不均一性以及蛋白质的自聚集性使蛋白质的行为更接近于溶液中，并不能完全展现出在受限空间中的特殊性质。为此，东京大学Makoto Fujita教授团队合成了一个具有较大空间的正八面体配位分子笼M12L24，并实现了对类角质酶的包裹，成为首例合成主体对蛋白质的主客体识别的报道。该工作以题为“Protein stabilization and refolding in a gigantic self-assembled cage”发表在《Chem》上。
【分子笼-蛋白质络合物的形成和表征】
为了评估受限空间中蛋白质的结构和性质，作者选择了一种类胶质酶CLE（21 kDa，最大直径4.5 nm）作为客体蛋白质。分子模拟研究表明，该蛋白质大小正好适合M 12L 24分子笼的空腔（5 nm）。同时，该蛋白质在研究条件下也比较稳定。另外，对于该酶的活性研究也比较容易，只需要监测405 nm处的吸收峰即可，该吸收峰是酶水解4-硝基苯基月桂酸酯生成的4-硝基苯酚的峰。其实，按照传统思路，如果先将分子笼组装好，CLE是很难进入笼空腔的。在该工作中，作者使用配体，金属离子与蛋白质CLE共组装的方式合成主客体组装体。使用50当量的配体1，25当量的Pd 2+以及1当量的CLE，在乙腈和水体积比为1：1的的溶液中经过24小时即可合成最终的组装体2。值得注意的是，由于配体在100% HEPES水的缓冲溶液中难以溶解，组装体的组装成功也得益于CLE在1：1乙腈和水溶液中的稳定性。核磁共振氢谱研究表明，未被分子笼包裹的CLE和位于笼中的CLE四级折叠结构基本一致，仅在柔性的环和端基处有一些差别。
图1. 组装体的构筑和蛋白质结构模拟
【限域空间中CLE的活性研究】
作者使用CLE水解4-硝基苯基月桂酸酯的反应来测试每个组分的活性。通过产物4-硝基苯酚在405 nm处的吸收峰的强度随时间的变化作为指标。通过每个时间产物的吸收峰，作者发现对于自由的CLE以及分子笼键合的CLE，它们水解4-硝基苯基月桂酸酯的活性基本相同，表明在限域空间中的CLE的活性并未受到组装的影响。另外，自由的CLE与分子笼M 12L 24单独的混合溶液也显示出了相同的水解活性，表明分子笼的存在不会影响CLE的催化活性。
图2. 催化活性研究
【溶剂依赖的CLE可逆结构改变】
在筛选催化条件时，作者发现，不同溶剂配比以及保存时间都会显著影响CLE-分子笼组装体的活性。为此，作者进行了详细的研究。首先作者发现，组装体在有机溶剂中的长时间存放会导致CLE的部分失活，然而在HEPES水溶液和乙腈的1：1混合溶液中，位于笼中的CLE又可以重新折叠回初始结构。以组装体的50%乙腈的HEPES水溶液作为起点，不断增大乙腈的比例，通过 1H- 15N HSQC NMR，可以发现从50%，60%，70%，80%到90%的乙腈会导致CLE核磁谱的不断变化，代表其结构的不断变化。通过透析将含有90%乙腈的溶液中的乙腈除去并恢复到50%，其核磁图谱可以恢复，表明在笼中CLE的可逆结构变化。作为对比，未被分子笼结构的CLE在这种条件下则会不可逆的失活。
图3. 溶剂依赖的可逆结构变化
总结：作者在这项工作中合成了一种具有较大空腔的分子笼M12L24，并将一种类角质蛋白CLE包裹在分子笼内，制备了一种分子笼-CLE组装体。首次实现了对合成分子主体限域空间中蛋白质结构和性质的研究。该工作为未来分子生物学的发展提供了一种独特的视角，它还可以作为一个平台来满足其他目前无法满足的生物化学需求。
全文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S2451929421003788
来源：高分子科学前沿
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