撰文 | Qi
游离DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）的体细胞突变分析在检测和表征癌症方面有着广泛的应用，循环肿瘤源性DNA（circulating tumor-derived DNA, ctDNA）作为一种新兴的肿瘤生物标志物，已在大多数癌症类型中得到证实。然而，在实践中，目前用于ctDNA分析的检出限（limits of detection, LOD）是不完善的，往往受到两个关键因素的限制，即来自血液采集的低DNA量和当前测序技术的本底错误率【1】。在治疗期间或治疗后检测残留病灶是一个强有力的预后工具，但目前的检测限不足以准确检测复发患者的残留灶，弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma, DLBCL）就是这种“检测缺失”的例子之一。
先前旨在降低 LOD 的方法侧重于在亲本DNA双链的两条互补链上检测到的体细胞变异，由于检测单核苷酸变异需要两个一致事件，因此双链测序降低了本底错误率【2-4】。然而，这种方法受到DNA双链体回收效率低下的限制，在所有回收的分子中，只有少数（通常为20–25%）分子同时回收了两条原链。因此，这种低效率使得双链测序在ctDNA检测中无法达到理想效果，仍需要开发一种同时达到低分析检出限和高分子回收率的方法。
2021年7月22日，来自斯坦福大学的Ash A. Alizadeh团队和Maximilian Diehn团队在Nature Biotechnology杂志上合作发表了一篇题为 Enhanced detection of minimal residual disease by targeted sequencing of phased variants in circulating tumor DNA 的文章，作者介绍了一种双链测序的替代方法，即检测“定相变异（phased variants, PVs）”，其中两个或更多突变发生在一条相同的DNA链上（cis），降低本底错误率的同时也能提高基因组回收效率（图1）。同时，作者开发了phasED-seq（phased variant enrichment and detection sequencing），通过PVs检测ctDNA达到约ppm（百万分率）级别，这种方法在治疗期间和复发之前都能有效提高临床样本的ctDNA阳性检测率，且能应用于实体瘤患者，提示phasED-seq在改善最小残留病（minimal residual disease, MRD）检测方面的广泛适用性。
首先，为了确定可用PVs提高疾病检出率的恶性肿瘤，作者分析WGS数据，评估了不同癌症类型的PVs的发生率，PVs在两种B细胞淋巴瘤中的表达最为显著，而这两种疾病都是已知的由AID驱动的高突变疾病。有趣的是，这些PVs分布在淋巴瘤中的特定基因组区域，其中，近三分之一的区域位于先前确定的与B细胞生理性或异常体细胞超突变（somatic hypermutation, SHM）相关位置，且PVs在每种淋巴瘤中的分布与相应疾病的已知癌症特征相关。
图1. cfDNA上SNV和PVs示意图
为了验证这些富含PVs的区域并评估其在ctDNA检测疾病方面的效用，作者设计了一个测序方案，目标是从三个独立的 DLBCL 患者队列以及慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中识别出的可能的PVs，并利用该方案从患者样品中鉴定PVs和追踪残留病灶（图2）。为了比较phasED-seq与已报道的ctDNA检测的其他方法（如CAPP-seq），作者将三名淋巴瘤患者的ctDNA稀释到健康对照cfDNA中，phasED-seq明显降低了本底错误率并改进了ctDNA的检出率。
图2. 测序方案的设计及应用
接下来，作者对一名接受DLBCL一线治疗的受试者的cfDNA进行了测序，使用基于SNV的方法即CAPP-seq仅在一个周期的治疗后便无法检测到ctDNA，而在250天后可再次检测到，五个月后患者出现疾病进展，提示SNV结果的假阴性。相反的是，SNVs检测不到的ctRNA可以通过phasED-seq检测到，这种增加的灵敏度大大提前了ctDNA的检测期。随后，作者进一步在107名接受标准化疗的B细胞淋巴瘤患者队列中验证了phasED-seq的优越表现。
虽然前面提到PVs分布在B细胞恶性肿瘤的特定基因组区域，然而，在大多数其他癌症类型中并非如此，尽管如此，在全基因组泛癌分析数据集中大多数癌症类型中确实存在足够数量的PVs，那么phasED-seq方法是否可以扩展到B细胞恶性肿瘤之外呢？为此，作者对来自于六名实体瘤患者的24份血浆样本进行了MRD的检测评估。利用SNV检测法仅在9/24份样本中检测到ctDNA，而phasED-seq检测到额外的6份样本中的ctDNA。此外，作者分析了一名接受放化疗的III期肺癌患者的样本，CAPP-seq和PhasED-seq在治疗前检测到相似的ctDNA水平；然而，治疗开始后且疾病复发再次出现ctDNA之前，CAPP-seq检测不到ctDNA，而phasED-seq对ctDNA的检测阳性率达到100%。
cfDNA在肿瘤学中的出现标志着精确医学的一场革命，虽然基于ctDNA的突变基因分型和MRD检测在临床上得到了广泛的应用，但目前的疾病监测方法的敏感性并不理想。在此背景下，这项研究提出了一种利用PVs来改善这些限制的方法，通过WGS确定多种癌症类型中PVs，并设计一种可应用于淋巴瘤和实体瘤的PhasED-seq方法，比先前已建立的ctDNA检测方法具有更高的灵敏度，检出限可降至百万分之一，对于肿瘤患者的预后具有重要意义。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41587-021-00981-w
参考文献
1. Abbosh, C., Birkbak, N. J. & Swanton, C. Early stage NSCLC—challenges to implementing ctDNA-based screening and MRD detection. Nat. Rev. Clin. Oncol. 15, 577–586 (2018).
2. Newman, A. M. et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 547–555 (2016).
3. Schmitt, M. W. et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 14508–14513 (2012).
4. Kennedy, S. R. et al. Detecting ultralow-frequency mutations by duplex sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586–2606 (2014).