点评丨陈鹏（北京大学）
责编 | 酶美
3CL蛋白酶（又称为主蛋白酶）在冠状病毒的生命周期中发挥至关重要的作用并且高度保守，是抗新冠病毒药物研发的重要靶点之一。
2021年6月15日，中国科学院上海药物研究所许叶春课题组、叶阳课题组联合中国科学院武汉病毒所张磊砢/肖庚富团队，在Nature Communications杂志在线发表了题为Identification of pyrogallol as a warhead in design of covalent inhibitors for the SARS-CoV-2 3CL protease的研究论文。该研究从天然产物杨梅素中首次发现了一类靶向SARS-CoV-2 3CL蛋白酶催化半胱氨酸的全新共价弹头——邻苯三酚，为共价抑制剂或探针分子的设计与发现提供了新颖的反应弹头。基于杨梅素与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶复合物的晶体结构设计得到了能有效抑制SARS-CoV-2复制并具有口服潜力的先导化合物，为新冠肺炎治疗药物的研发提供了一类不同于拟肽结构的新型小分子抑制剂。
前期，研究团队发现黄芩素是SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的非共价、非拟肽类抑制剂，复合物晶体结构解析揭示了黄芩素独特的结合模式，进一步结构分析发现黄酮骨架是黄芩素与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶结合的重要药效团。
图1. SARS-CoV-2 3CL蛋白酶与黄芩素（a）、杨梅素（b）及杨梅素衍生物（c）结合复合物的晶体结构
基于上述发现，研究团队对黄酮类天然产物进行筛选，发现了两个SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的强效小分子抑制剂——杨梅素和二氢杨梅素。通过解析杨梅素与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶复合物的晶体结构揭示了杨梅素出乎意料的共价结合模式，从而发现邻苯三酚基团可作为靶向SARS-CoV-2 3CL蛋白酶催化半胱氨酸的选择性共价弹头。超高分辨质谱分析结果进一步验证了杨梅素与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的共价结合。同时杨梅素与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶结合的动力学参数测定、杨梅素与GSH反应性测定、基于ABPP的选择性评价均表明以邻苯三酚为反应弹头的杨梅素具有较好的选择性。此外，研究团队通过量子化学计算探讨了此类反应弹头的共价机制。
接下来研究团队基于杨梅素的结合模式开展了基于结构的药物设计工作。结构分析发现杨梅素的7位羟基朝向溶剂区，为提高活性及改善理化性质，研究团队在此羟基上引入疏水性基团以及磷酯基团，设计并合成了一系列杨梅素衍生物，最终得到一个抗病毒活性较好的磷酸盐前药以及口服生物利用度达18.1%的衍生物，为抑制新冠病毒复制提供了活性良好且具有口服给药前景的先导化合物。
综上，研究团队发现了一类新型的共价反应弹头——邻苯三酚，可用于靶向SARS-CoV-2 3CL蛋白酶催化半胱氨酸及其它靶蛋白半胱氨酸的共价抑制剂的设计。许多天然产物中均含有邻苯三酚基团，该发现也提示此类天然产物可能以同样的机制共价作用于靶蛋白。此外，通过基于结构的抑制剂设计得到具有口服给药前景的先导化合物，为新冠肺炎的治疗药物研发提供了潜在的口服小分子抑制剂。
中国科学院上海药物研究所博士生苏海霞、姚胜研究员、博士后赵文峰、武汉病毒研究所博士后张宇旻、上海药物研究所正高级工程师刘佳以及邵强研究员为本文的共同第一作者，上海药物研究所许叶春研究员、叶阳研究员以及武汉病毒研究所张磊砢副研究员为共同通讯作者。该工作还得到了上海药物研究所徐华强研究员、戴辉熊研究员以及上海同步辐射光源的支持。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-23751-3
专家点评
陈鹏（北京大学）
在新冠病毒疫情爆发初期，我国研究者发现了中药黄芩中的黄芩素可以有效抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶及新冠病毒复制。在这一工作的基础上，中科院上海药物所许叶春/叶阳/蒋华良团队联合中科院武汉病毒所张磊砢/肖庚富团队，根据黄芩素的结构线索，从中草药资源宝库中新发现了一类SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的强效小分子抑制剂——杨梅素。该工作的核心亮点之一，是他们通过复合物晶体结构解析，发现杨梅素通过其邻苯三酚基团与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的催化半胱氨酸发生了“共价结合”。为了阐明邻苯三酚作为一类新颖的共价弹头与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶催化半胱氨酸发生共价修饰的机制，研究者首先检测了缺氧和有氧条件下杨梅素与谷胱甘肽（GSH）的反应速率，发现有氧条件下杨梅素更易与谷胱甘肽（GSH）发生反应，说明邻苯三酚的自氧化生成类Michael受体——邻苯二醌活性中间体是发生共价结合的关键，可能代表一类新型的Michael加成反应。随后研究者结合复合物晶体结构和量子化学计算，认为当杨梅素与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶结合时，活性结合口袋中的145-位催化半胱氨酸与邻苯二醌活性中间体发生亲核反应，从而实现与杨梅素共价结合，产生对SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的强效抑制作用。在此基础上，研究者针对杨梅素开展了系列基于结构的药物设计工作，最终得到了口服药代性质改善的7-位甲基化二氢杨梅素衍生物和抗病毒活性较好的磷酸盐前药，为新冠肺炎的治疗药物开发提供了先导化合物，具有良好的应用前景。该研究工作中新发现的邻苯三酚不仅丰富了共价修饰弹头工具库；同时，由于酚类结构骨架广泛存在于天然产物中，为下一步开发和研究基于邻苯三酚结构骨架的共价天然产物药物提供了理论支持。