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充满质疑,却又成果不断!中科院神经所杨辉团队再发重磅成果

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iNature前沿 2021-05-04 08:28

近一年来,中国科学院神经研究所杨辉团队连续取得突破,在Cell, Protein & CellNature Communications ,Nature Cell Biology,Nature Protocol,Nature Methods 等杂志上发表了7项重要研究成果,在基因编辑领域取得重大进展,iNature系统总结了这些研究成果:

【1】微生物和病毒之间的竞争性共同进化导致CRISPR-Cas防御传染病的防御系统多样化。2021年5月3日,上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉,周英思和中国农业大学农学院赖锦盛共同通讯在Nature Methods(IF=30·82) 在线发表题为“Programmable RNA editing with compact CRISPR–Cas13 systems from uncultivated microbes”的研究论文,该研究通过分析宏基因组的terabase数据集,鉴定了来自高盐样品的CRISPR-Cas核糖核酸的两个紧凑家族(775至803个氨基酸(aa)),命名为Cas13X和Cas13Y。该研究设计了Cas13X.1(775 aa),用于哺乳动物细胞系中的RNA干扰实验。该研究发现Cas13X.1可以耐受RNA识别中的单核苷酸错配。此外,由工程化脱氨酶(385氨基酸)和截短的Cas13X.1(445氨基酸)组成的最小RNA碱基编辑器表现出强大的编辑效率和高特异性,可诱导RNA碱基转化。该研究结果表明,天然微生物中存在尚未开发的细菌防御系统,可以有效地在哺乳动物细胞中发挥作用,因此可能对基于RNA编辑的研究有用。

【2】CRISPR-Cas13和CRISPR-Cas12系统中新发现的特征(如“附带效应”或反式切割)已使其能够用于核酸检测。据报道,Cas13a的侧链RNA切割对细胞发育有害。作为CRISPR-Cas12系统的代表性基因编辑器,CRISPR-Cas12a(Cpf1)在未来的治疗应用中具有巨大潜力。然而,当用于哺乳动物细胞中的基因组编辑时,目标激活的Cas12a有在复制,转录和同源性导向的修复过程中裂解瞬时暴露的ssDNA的风险,引起了人们的关注其治疗应用。因此,需要仔细研究由Cas12a的不加区分的ssDNA裂解活性引起的潜在脱靶效应。2021年4月1日,中国科学院神经研究所周昌阳,杨辉及中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟等共同通讯在Protein & Cell 在线发表题为“Indiscriminate ssDNA cleavage activity of CRISPR-Cas12a induces no detectable off-target effects in mouse embryos”的研究论文,该研究开发了GOAT,无需FACS即可检测基因编辑工具对全基因组的脱靶效应。与GOTI相比,GOAT是一种更简单,成本更低的方法,具有相当的准确性和灵敏度。使用GOAT分析,该研究发现Cas12a(LbCas12a和AsCas12a)的反式ssDNA切割活性在小鼠胚胎中较低,这表明Cas12a在哺乳动物细胞中具有高度特异性。考虑到LbCas12a和AsCas12a具有与spCas9相当的编辑效率,更小的尺寸和更低的错配耐受性,它们在未来的治疗应用中具有广阔的前景和竞争优势。

【3】2021年1月4日,中国科学院神经研究所杨辉及周海波共同通讯在Nature Cell Biology 在线发表题为“Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundance transcripts and lncRNAs”的研究论文,该研究开发了一种通用的内源性转录门控开关,该开关在存在内源性启动子的情况下释放单向导RNA。 当内源转录门控开关与开发的高度敏感的CRISPR激活物相关报道分子偶联时,可以可靠地检测内源基因的活性,包括表达水平非常低的基因(相对于Gapdh,<0.001;定量PCR分析) 。值得注意的是,该研究还可以使用这种方法监测在活细胞中低水平表达的典型的长非编码RNA的转录活性。总之,该研究方法提供了一个强大的平台,可以感知细胞功能背后的内源性遗传元素的活性。

【4】2020年11月27日,上海科技大学黄行许,池天及中国科学院神经研究所杨辉共同通讯在Nature Communications 在线发表题为“A Cas-embedding strategy for minimizing off-target effects of DNA base editors”的研究论文,该研究发现只需将将编辑酶插入nCas9的中间,就可以显著降低A> G和C> T编辑器的脱靶效应,而不会破坏靶上编辑。 此外,采用这种Cas嵌入策略,该研究创建了一个高度特定的编辑器,能够对甲基化和富含GC的序列进行高效C> T编辑。

【5】2020年8月14日,中国科学院神经研究所杨辉,中国科学院上海营养与健康研究所李亦学及斯坦福大学Lars M. Steinmetz通讯共同在Nature Protocol 在线发表题为“GOTI, a method to identify genome-wide off-target effects of genome editing in mouse embryos”的研究论文,该研究为GOTI提供了详细的技术方案,包括小鼠交配,两细胞胚胎注射,胚胎第14.5天胚胎消化,荧光激活细胞分选,全基因组测序和数据分析。为了增强GOTI的效用,该研究还包括一个称为GOTI-seq(https://github.com/sydaileen/GOTI-seq)的计算流程,用于测序数据分析,可以生成最终的全基因组脱靶变异体直接从原始测序数据中提取。从小鼠交配到测序,该试验方法通常需要20天,而测序数据分析则需要7天。

【6】2020年5月18日,中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉,究所隶属于的计算生物学研究所(中国科学院-马普学会计算生物学研究所)李亦学及中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟共同通讯在Nature Methods 在线发表了题为"A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-targeteffects"的研究论文,该研究根据蛋白结构预测了脱氨酶ssDNA结合的重要氨基酸,在不影响催化活性的情况下,突变相应的氨基酸(APOBEC1上的ssDNA结构域相应氨基酸),从而得到了显著降低DNA脱靶的CBE突变体。

【7】2020年4月8日,中国科学院上海神经所杨辉及周海波共同通讯在Cell 在线发表题为“Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice”的研究论文,该项研究通过运用最新开发的RNA靶向CRISPR系统CasRx特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低Ptbp1基因的表达,首次在成体中实现了视神经节细胞的再生,并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时,该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元,并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。

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在广泛的微生物群落中,CRISPR–Cas系统被分为六个亚型和许多直系同源物。最近在II型和V型家族的未培养微生物中发现紧凑型CRISPR系统的研究,进一步拓宽了对各种CRISPR机制与传染原之间广泛协同进化的认识。此外,由于通常用于治疗持久性疾病的腺伴随病毒(AAV)的体内传递限制,紧凑型CRISPR效应器非常适合产生基于CRISPR的治疗方式。

与Cas9和Cas12的DNA靶向活性相反,Cas13是最近在VI型CRISPR系统中鉴定出的一种单独的效应子,用于RNA引导的RNA干扰活性。CRISPR–Cas13可以为哺乳动物细胞和植物中的RNA研究提供广泛的应用,例如实时成像,RNA降解,碱基编辑和核酸检测。先前已经确定了分为四个家族的众多Cas13效应子;然而,天然微生物中CRISPR–Cas13系统的未知空间仍然难以捉摸。

在这里,该研究在宏基因组学数据集中确定了两个紧凑的CRISPR–Cas13家族,并对其进行了工程改造,以实现哺乳动物细胞中的RNA降解和RNA碱基转化。

该工作成功从未获培养微生物宏基因组数据中鉴定到了两个新的Cas13系统,极大地丰富了Cas13家族的多样性。而且通过大量实验证明了Cas13X.1在RNA编辑方面具有非常大的应用潜力,小尺寸很好地解决了Cas13体内递送的问题,有望在未来成为一种高效安全的RNA治疗方法,为疾病(尤其是罕见病)的基因治疗提供更多的选择。

该项工作由中科院脑智卓越中心博士后胥春龙、周英思和博士研究生肖庆全、博士后贺冰冰与耿冠男等研究人员,在中科院脑智卓越中心杨辉研究员、周英思博士和中国农业大学农学院赖锦盛教授的指导下完成,研究组的博士后汪子康、董雪、研究生曹碧蓉和本科生王一凡等其他成员积极参与,并得到了脑智卓越中心流式分选和高性能计算集群平台的大力协助。本工作得到科技部、中科、国家基金委、上海市的资助。

参考消息:

https://www.nature.com/articles/s41592-021-01124-4

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