在哺乳动物中,Sirtuins家族中有7 个成员,沉默信息调节因子2相关酶类(SIRT)1~7,它们分别定位于细胞的不同位置,而SIRT3是唯一定位于线粒体的去乙酰化酶,它可以通过控制蛋白的乙酰化/去乙酰化水平调节线粒体中酶的活性,影响线粒体功能及细胞生理状态。SIRT3不仅影响能量代谢过程,包括三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸氧化及酮体的生成,还参与维持线粒体的氧化还原稳态。线粒体内电子传递过程中因电子泄漏产生的活性氧可损伤线粒体内外的大分子及细胞膜结构,是目前公认的与衰老相关的病理机制之一。

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根据结构特点,本实验选取了常见的食物原料葡萄、茶叶、石榴、青稞中的7 种代表性多酚类化合物,包括白藜芦醇、山柰酚、石榴皮鞣素、安石榴苷、矢车菊素、飞燕草素葡萄糖苷、漆树黄酮,以及咖啡豆中的咖啡醇作为筛选SIRT3激活剂的候选化合物(表1)。

前期研究表明,这8 种化合物在人结肠癌细胞Caco2中对SIRT3的转录激活作用有不同的影响,中国农业大学食品科学与营养工程学院的陈 慧、赵 冲*等人将进一步探究这8 种化合物对于人正常皮肤永生化角质形成细胞(HaCaT)中的SIRT3转录活性的影响,并且以中波紫外线(UVB)诱导的HaCaT细胞衰老模型,探究SIRT3多酚激活剂是否可以通过SIRT3介导的抗氧化应激途径减少UVB诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤,从而修复细胞衰老。

1、多酚类化合物对HaCaT SIRT3转录活性的影响

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通过对EGEP进行荧光定量分析(图2),结果表明,与二甲基亚砜(DMSO)组(对照组)相比,白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮和咖啡醇显著增强了EGFP荧光强度。石榴皮鞣素、矢车菊素和飞燕草素葡萄糖苷对SIRT3的转录活性影响不显著。

本研究进一步利用qPCR技术,检测了白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮和咖啡醇对HaCaT内源性SIRT3基因表达水平的影响(图3),发现SIRT3基因表达水平均有显著上调,与它们增强EGFP水平的结果具有一致性。因此,白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮和咖啡醇能上调HaCaT中SIRT3基因的表达。

2、SIRT3多酚激活剂对UVB诱导的细胞内ROS相对含量的影响

图4A结果显示,UVB照射剂量为10 mJ/cm2时,与空白组相比,细胞内ROS相对含量显著增加(P<0.05),6、8 mJ/cm 2 的UVB照射剂量对细胞内ROS相对含量没有显著影响。因此,UVB照射剂量为10 mJ/cm2可作为诱导细胞衰老以及筛选抗自由基多酚化合物的最佳剂量。HaCaT在10 mJ/cm2的UVB照射剂量处理之后,SIRT3多酚激活剂白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮及咖啡醇均以10 μmol/L的浓度干预48 h,按照上文中的方法测定细胞内ROS相对含量,结果如图4C所示。为了排除化合物自身对细胞内ROS的影响,同时也检测了无UVB照射且其他条件相同的情况下细胞内ROS相对含量(图4B)。结果显示,当无UVB照射时,相比于DMSO组,白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮及咖啡醇处理之后,细胞内ROS相对含量没有显著变化,表明这些化合物不会改变正常细胞内ROS的水平。当照射剂量为10 mJ/cm2时,白藜芦醇、安石榴苷、漆树黄酮及咖啡醇均显著降低了UVB诱导细胞产生的ROS相对含量,且差异具有统计学意义(P<0.01),山柰酚处理组与对照组中细胞内ROS相对含量无显著差异。总而言之,除山柰酚外,其他SIRT3多酚激活剂均能降低UVB诱导的细胞氧化应激水平。

3、SIRT3多酚激活剂对UVB诱导的细胞SA-β-gal活性的影响

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如图5所示,细胞从左往右分布,表明细胞体积逐渐增大。与未经UVB照射处理的细胞相比,10 mJ/cm2照射剂量处理下的细胞体积变大,SA-β-gal染色阳性细胞明显增多,即处于衰老状态的细胞数量增多。所以10 mJ/cm2照射剂量的UVB处理可以诱导细胞衰老的发生。本研究分别评价了前期筛选得到的SIRT3多酚激活剂白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮及咖啡醇对细胞衰老的影响,测定它们对UVB处理之后HaCaT SA-β-gal活性的影响。

图6表明,在这5 种化合物中,安石榴苷显著降低了细胞SA-β-gal活力(P<0.05),而其他4 种化合物对细胞SA-β-gal活力均没有显著影响。以上研究结果表明,安石榴苷能有效抑制UVB诱导的皮肤细胞衰老。

4、SIRT3多酚激活剂对细胞SOD2相对活力和GSH/GSSG比值的影响

由图7可知,白藜芦醇与咖啡醇处理组细胞的SOD2活力显著增强,而其他多酚类化合物对SOD2活力没有显著性影响。

图8中激活SIRT3的多酚类化合物均提高了细胞GSH/GSSG比值,且与DMSO组相比有显著性差异,其中安石榴苷与山柰酚的作用效果最佳,GSH/GSSG比值均提高了4 倍以上。

讨 论

综上所述,通过SIRT3-EGFP报告基因系统筛选得到5 种多酚类化合物具有增强SIRT3基因表达的作用,分别是白藜芦醇、山柰酚、安石榴苷、漆树黄酮和咖啡醇;白藜芦醇、安石榴苷、漆树黄酮以及咖啡醇均能有效降低UVB诱导的细胞内ROS水平;这5 种多酚均显著提高了GSH/GSSG比值,白藜芦醇与咖啡醇显著增强了SOD2活性;安石榴苷不仅可以激活SIRT3,修复细胞的抗氧化系统,缓解UVB诱导的HaCaT衰老,其抗衰老机制可能与SIRT3-NADPH-GSH/GSSG抗氧化途径有关。本研究更加确证了安石榴苷在抗衰老方面的作用并初步探究了其机制,今后将进一步从动物体内水平评价安石榴苷在抗衰老方面的效果,并从分子水平深入阐明其作用机制,为安石榴苷在功能食品、护肤产品等方面的应用提供充分的理论依据。

本文《SIRT3多酚激活剂的筛选及其对UVB诱导HaCaT细胞衰老的修复作用》来源于《食品科学》2021年42卷5期115-121页,作者:陈慧,YOSHINORI Katakura,扈洪波,尹淑涛,赵冲。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191230-357。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑:袁艺;责任编辑:张睿梅

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