撰文 | 木兰之枻
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CRISPR-Cas9基因编辑技术风头正劲，2020年的诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier便因此获奖。临床应用中，CRISPR-Cas9技术也突破连连：2019年，研究者便尝试利用CRISPR编辑干细胞治疗HIV和白血病患者（详见BioArt报道：专家点评NEJM |世界首例！陈虎/邓宏魁/吴昊合作团队报道首例CRISPR编辑干细胞治疗HIV和白血病患者）；2020年，研究者将CRISPR用于β-地中海贫血症和镰刀状细胞贫血症的临床治疗并取得初步成功【1】。不过，作为一种外源的基因组切割系统，CRISPR-Cas9技术潜在的安全风险也广受关注。2018年以来，有多项研究指出CRISPR系统能激活p53而引发DNA损伤，最终干扰其基因编辑效率（详见BioArt报道：两篇Nat Med致CRISPR股票大跌，这回是因为p53；Nat Genetics | Cas9蛋白本身可激活p53通路并促进p53失活型突变的择性富集）【2，3，4】；研究还发现，CRISPR-Cas9还会导致包括大片段缺失在内的各种复杂的染色体结构异常乃至染色体整体缺失（详见BioArt报道：NBT丨CRISPR编辑技术面临新的安全隐患——胡家志点评；Cell特别关注 | CRISPR编辑人类胚胎存在高风险——导致染色体大段甚至整体缺失）【5, 6】。2020年，研究者还发现，Cas9蛋白能直接结合DNA-PK复合物而干扰DNA修复通路（详见BioArt报道：特别关注丨 CRISPR-Cas9系统的新风险——破坏DNA-PK依赖的修复通路引发DNA损伤）【7】，这提示我们，CRISPR-Cas9基因编辑技术的安全风险仍有待进一步的探索。
2021年4月12日，来自霍华德·休斯医学研究所（HHMI）和哈佛医学院的David Pellman实验室与圣裘德儿童研究医院的Mitchell J. Weiss实验室合作在Nature Genetics杂志上发表了题为Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR–Cas9 genome editing的论文。文章对CRISPR-Cas9基因编辑技术的安全风险做了进一步评估。研究者通过单细胞全基因组测序发现，CRISPR-Cas9基因编辑会破坏细胞核结构，导致微核和染色体桥的出现，最终导致染色体碎裂。考虑到染色体碎裂会显著增加先天性疾病和癌症的发病风险，CRISPR-Cas9基因编辑技术的安全性仍需要深入研究和仔细评估。
Cas9蛋白在特定gRNA的引导下，会切割目标染色体引入DNA双链断裂（DSB），此时断裂的染色体会形成无着丝粒染色体断片和有着丝粒染色体断片两部分。如果DSB无法在细胞分裂前修复完成，无着丝粒染色体断片有形成微核的风险。为评估微核形成风险，研究者选用人端粒酶（hTERT）介导的永生化细胞系人视网膜色素上皮细胞（hTERT RPE-1）开展相关研究。研究者首先进行细胞周期同步化处理，随后转染Cas9-gRNA的RNP复合物，选用的gRNA共四种，它们分别靶向不同染色体，其中包括已用于地中海贫血和镰刀状细胞贫血临床治疗研究的gRNA（靶向BCL11A增强子）。研究显示，CRISPR-Cas9基因编辑明显促进微核形成，处理组里微核的出现频率比对照组高10-20倍。荧光原位杂交实验（FISH）显示，81-92%的微核中的染色体断片来自gRNA靶向的目标染色体。此外，绝大多数微核中包含双拷贝的染色体断片，且主要为无着丝粒染色体断片。研究还指出，等位基因特异性的gRNA同样会促进微核形成。
微核的形成往往会导致染色体碎裂。为此研究者利用一种将长时程活细胞成像与单细胞全基因组测序结合的技术Look-Seq，对细胞内的染色体碎裂情况进行分析。考虑到Cas9会激活p53干扰基因编辑效率并影响含微核细胞的分裂，研究者先短时抑制p53表达而后开展微核诱导实验。通过对含微核子细胞分裂后的18对“孙女”代细胞进行全基因组测序，研究者发现所有测序细胞中均有染色体结构变异，且绝大多数细胞中出现染色体碎裂现象（详见图1）。研究者还指出，p53表达与否不影响微核形成的频率，但p53能抑制含微核细胞的分裂：p53表达正常的含微核细胞中，54%无法进行正常的细胞分裂，p53敲减后该比例降至8%。
除促进微核形成而诱导染色体碎裂，Cas9对染色体的切割还会导致染色体桥的形成（图1）：全基因组测序的18对“孙女”代细胞中，8对细胞中有染色体桥形成的证据。此外，荧光成像实验还发现，p53敲除后的含微核细胞中，13.8%的细胞在分裂时会形成染色体桥结构。
图1. 18对“孙女”代细胞的基因组结构性变异汇总。
近来CRISPR-Cas9基因编辑已被用于β-地中海贫血症和镰刀状细胞贫血症的临床治疗且结果喜人。为研究这一临床应用是否有导致染色体碎裂的风险，研究者采用相似的研究策略，在人源CD34阳性造血干和祖细胞（HSPCs）中电转染靶向染色体2p位置BCL11A增强子的Cas9-gRNA的RNP复合物。结果显示，该策略对靶位点的编辑效率高达89.4%，且胎儿血红蛋白HbF的表达水平增加了近5倍，这表明该研究策略确能改善贫血患者血红蛋白不足的问题。不过该策略依然会促进微核的形成，其微核形成频率比对照组高16倍。FISH染色也证实，80%含微核细胞中无着丝粒染色体断片的拷贝数发生改变。此外，7.3%无微核细胞中目标染色体臂的数目异常。光谱核型分析（SKY）指出，3.25%的细胞在染色体2p处存在断点。研究者还发现，12.9%的微核中组蛋白H2AX磷酸化水平明显增加，表明存在严重的DNA损伤情况。由于HSPCs是悬浮细胞，因此无法通过Look-Seq技术分析染色体碎裂情况。不过，现有的结果已经足够证实CRISPR-Cas9基因编辑存在严重的安全风险。
总体而言，本研究通过细胞系和临床应用级别的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)实验证实，CRISPR-Cas9技术会促进微核和染色体桥等结构变异的出现，最终增加染色体碎裂的风险，而染色体碎裂与人类先天性疾病及癌症均密切相关。本研究提醒我们，除脱靶风险外， Cas9在编辑靶位点时对染色体本身的破坏值得高度重视。目前CRISPR-Cas9技术已经进入临床研究用于疾病治疗，其引发染色体碎裂的风险更加值得关注。本研究也提醒研究者，我们对CRISPR-Cas9技术的安全风险及相关机制的认识仍有欠缺，未来仍需要更多研究关注其应用过程中的潜在风险。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41588-021-00838-7
参考文献
1．Frangoul, H. et al. CRISPR–Cas9 gene editing for sickle cell disease andβ-thalassemia. N. Engl. J. Med. 384, 252–260 (2021)
2．E. Haapaniemi et al., CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med, (2018).
3．R. J. Ihry et al., p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med, (2018).
4. Enache, O. M. et al. Cas9 activates the p53 pathway and selects for p53-inactivating mutations. Nat. Genet. 52, 662–668 (2020)
5. Michael Kosicki et al., Repair of CRISPR–Cas9-induced double-stranded breaks leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol, (2018).
6. Zuccaro, M. V. et al. Allele-specific chromosome removal after Cas9 cleavage in human embryos. Cell 183, 1650–1664 (2020).
7．Xu, S. et al., CAS9 is a genome mutator by directly disrupting DNA-PK dependent DNA repair pathway. Protein Cell 11, 352–365 (2020).