近日，合成生物学领域再出震撼性的进展：研究人员为人工合成的 “最简化细胞” JCVI-syn3.0 添加了最少数量的基因 “补丁”（仅 7 个），成功修复了其在生长分裂中细胞形态上所存在的问题。
这项工作由 J. Craig Venter 研究所（JCVI）、美国国家标准技术研究院（NIST）及麻省理工学院（MIT）的研究团队带来，相关研究成果刊登在了 3 月 29 日的 Cell 期刊上。
图丨基因组上最小细胞进行细胞分裂的基因需求（来源：Cell）
具体来说，这 7 个基因补丁是与 “控制细胞分裂及形态” 的密切相关的一组基因。研究人员能够在数百个基因中完成了对该 7 个基因的准确定位和筛选，背后所使用的合成生物学方法论便是 ——“遗传学逆向分析”。
“遗传学逆向分析提供了一种令人信服的合成生物学方法，来研究基本基因之间相互作用的基本生理过程。” 研究人员在文中写道。
分裂形态的问题及其 “补丁”？遗传学逆向分析定位功能基因？不妨让我们带着这些关键词，一起进到研究之中去感受合成生物学的魅力。
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“化简” 基因组带来的变异
追本溯源，此次研究者所修正的 “最简化细胞”，其实便是 2010 年那惊艳世人的 “首例人造生命” 的研究延续。
时针拨回到 2010 年，彼时的研究人员构建出了第一个人造细胞 ——“合成支原体” JCVI-syn1.0。这项工作分为三步：获取、优化丝状支原体的基因组，人工合成该基因组，最后将其移植进山羊支原体空壳细胞内。
最终，这个被掏空的空壳细胞在人工基因组的控制下 “起死回生”，成为了第一例 “人造生命”。这项成果意义非凡，是合成生物学领域的标志性事件之一，并入选了美国《时代》周刊评选的 2010 年十大医学突破之一。
图丨 2010 年十大医学突破之其二：合成细胞（来源：TIME）
毋庸置疑，这是一个阶段性的胜利。不过研究人员并没有因此而停下脚步，在第一例人造细胞的背后，仍有着许多尚待深挖的 “宝藏” 和 “疑问”，如能否 “化简” 基因组、理清各基因模块的功能、找到控制细胞生存分裂的核心序列等等。
“我们的目标是了解每个基因的功能，以便我们能够开发出一个完整的细胞运作模型。” 论文的第一作者 James F. Pelletier（詹姆斯。佩尔蒂埃）这样说道。
这并不是纸上谈兵，研究人员正在践行着自己的想法。6 年时间内，研究人员不断地分析、测试及删除基因组中的非必需基因，成功将细胞的基因数从原本的 901 个减少到了 512 个，到了第三代 JCVI-syn3.0 发布之时，数量更是降到了仅有 473 个。
这个仅在 473 个基因的控制下存活下来的第三代细胞 JCVI-syn3.0，便是目前已知了的 “最简化基因组” 的细胞，也正是此次研究施加补丁的对象。
第三代细胞发布于 2016 年的 Science 之上，虽有着 “最简化细胞” 的美誉，但是其也有着美中不足的缺憾：表型上与第一代细胞有着巨大的差异。具体来说，便是细胞分裂所产生的形态变得大小不一，同时细胞还从其原本的独立分布变成了聚集成团。
图丨第一代细胞和第三代合成细胞在分裂形态上产生了明显的差异（来源：Cell）
这些在细胞分裂形态所产生的变化，意味着研究人员误删了一些分裂形态相关的必要基因，这也让此次的“化简”基因组显得并不那么完美。
在经过 5 年时间的探索后，研究人员终于在最简化的基础上完成了 BUG 修复，在这项研究中，研究人员发现和确认了 “控制细胞分裂形态” 的 7 个必需基因。
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遗传学逆向分析
通过一层层地抽丝剥茧，研究人员从 428 个被删减掉的基因模块之中筛选出了 7 个必要的基因模块，而将这 7 个基因模块导入到第三代细胞之中后，细胞又重新回复到与第一代近乎一致的分裂形态。
而在这背后，研究人员分析确认这 7 个基因所使用方法，与 “化简” 基因组的方法是一致的，都是 “遗传学逆向分析”，至下而上的基因分析。
要想更好地理解 “遗传学逆向分析”，第三代细胞 JCVI-syn3.0 的构建便是再合适不过的例子。在该细胞的构建过程中，遗传学逆向分析的具体操作为：先确认了基因模块的必要性，而后再分段组合基因组进行功能对比和分析。
让我们先来看第一步：基因模块必要性的确认，在这一步之中，研究人员使用了基因组改造的常用工具：Tn5 转座酶。Tn5 转座酶，最早发现于大肠杆菌的转座子，其能够携带基因片段，然后随机插入到基因组之中。
图丨 Tn5 转座酶随机插入基因示意图（来源：WISC）
研究人员正是利用了 Tn5 转座酶的随机性，向第一代细胞 JCVI-syn1.0 的基因组中进行无差别的随机插入，一旦基因组中功能基因被成功击中，那么其将大概率会因为移码突变而失去原有的功能。
基于上述原理，研究人员首先对每个菌株进行 1 次、最终完成了 30000 次功能基因的有效插入，并由此分析测序，获得了数据库 1；之后，为了鉴别被插入基因是否影响细胞生长，研究人员将这些菌株收集起来一起培养了 40 代，这些培养后的细菌也被重新分析测序，共获得 14000 次菌次的数据库 2。
这两个数据库，便是研究人员确认基因模块必要性的基础。通过大量随机插入，在数据库 1 中的被插入的基因代表了该基因的缺失并不致死；而数据库 2 则是对数据库 1 的二次筛选，在数据库 2 不存在的基因往往与细胞的生长分裂息息相关，才会使得其在 40 代的培养中被淘汰掉了。
于是，通过对比两个数据库，第一代细胞中的 901 个基因模块总共被分成了三类：
第一类是必要基因（essential），它在两个数据库之中都存在，说明了其在细胞的正常功能和生长发挥着重要作用，共 240 个；而两次数据库中都不存在的便被认为是与细胞基础功能不相关的，列为非必要基因（non-essential），共计 432 个。
此外，还剩下 229 个准必要基因（quasi-essential），其分选的标准是存在于数据库 1 而不存在于数据库 2。
图丨随机插入后的三类基因（来源：Science）
到了目前这一步，基因的必要性似乎已经非常清楚了，下一步是不是只需要将这些非必要基因去除就能够得到 “最小化的基因组” 呢？
很显然，答案是否定的，因为生物系统并没有这么简单，许多单基因的功能并不是相互垂直独立。
“假设基因 A 和基因 B 各自都提供基本功能 E1。在单个基因敲除研究中，可以删除其中任何一个基因而不会使得 E1 失效，因此他们都被归类到了非必需基因。但是，一旦两个都被删除，那么 E1 将彻底失效。” 研究人员解释道。
因此，为了进一步确定各个基因的相互作用，研究人员将基因组分成了 8 片段 2 类别。8 个片段，指是研究人员将整个基因组分为拆分成了 8 个大模块，2 大类别，便是这些大模块还分别分为未去除非必要基因的 syn1.0 和去除了非必要基因的 RGD（reduced genome design，缩减基因组的设计）两类。
图丨 syn1.0 的基因被分为了 8 个模块（来源：Cell）
通过不同模块之间的组合分析，研究人员发现：在 RGD 的 2、6、7、8 片段组合到一起时，细胞能够存活，不过在这种组合下的 RGD 1、3、4、5 片段是无法直接使用的。
“这其中有一些非必要基因转变成了必要基因或者准必要基因。” 研究人员写道。
不过不用担心，这些发现转变的基因，通过直接对比分析 syn1.0 和 RGD 的差异片段，便可以圈定一个大体范围，而后通过分析和研究，便能够将发生改变成为必要基因的最简化基因给筛选出来。
最终，那些发生了转变的基因模块会被筛选出来，回添并优化成为第三代细胞 JCVI-syn3.0。同样的，此次 “控制细胞分裂及形态” 的相关基因，也是通过片段之间性状对比分析，之后再对单基因分析得到的。
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确定并导入细胞分裂必需基因
视线拉回到此次的研究，由于在分裂形态上存在着明显差异，研究人员仅需观察便可以很容易地完成 “遗传学逆向分析” 中的基因片段定位这一步。
研究人员分别改造了8组细胞，即将之前所分的8个基因片段分别替换进第一代细胞 JCVI-syn1.0 中，之后观察了各细胞及初始细胞的分裂形态：
图丨各基因组的细胞分裂形态（来源：Cell）
在细胞形态上重新检查这些菌株，相信大家也能一眼发现那与众不同的一株菌 —— 替换了 6 号片段的菌株。在 8 组替换片段中，只有它的形态显示出了与第三代细胞高度一致，而其他替换片段都是趋于正常第一代细胞的形态。
目标就此确定，研究人员便从 6 号最小化片段中被删除的 76 个基因入手，逐步缩小范围，在 2019 年 1 月的 elife 上，研究人员便曾公布过回添了 20 个基因后共 493 基因的修复版。而这次所确定的 7 个基因，则是缺一不可的最简化版本。
“我们分别测试了每一个剩余的基因，删除了七个基因中的每一个。如果不希望重回 JCVI-syn3.0 异样的细胞分裂形态，这七个基因之中将没有一个可以被去除。这提供了强有力的证据，证明所有七个基因都是必要的。” 研究人员写道。
图丨分别删除任一基因都会导致分裂出的形态异样（来源：Cell）
值得一提的是，这 7 个基因的具体功能只有 2 个是明确的，其余 5 个的具体功能是尚且未知的，不过通过遗传学逆向分析，研究人员现在知道了其在支原体细胞分裂和形态中有着至关重要的作用。
正如研究人员在文中所写的那般，“最简化细胞” 和 “遗传学逆向分析” 对于合成生物学都有着极其重要的意义：“这些菌株为细菌生理学提供了令人信服的最小模型，并为更广泛的工程生物学提供了平台。”
“在不了解基因功能的情况下，我们的系统方法发现了它们调控正常细胞分裂和形态的功能，这些功能也可能适用于支原体以外的生物。这些先前未表征过的基因功能，以及细胞正常分裂和形态的多基因基础，将为自下而上地重构合成生物提供有用的信息。”
论文链接：
https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(21)00293-2.pdf
https://science.sciencemag.org/content/351/6280/aad6253
https://elifesciences.org/articles/36842
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