提到 lncRNA、circRNA，大家最先想到的研究热点是什么？lncRNA 的 cis、trans？还是 circRNA 的 ceRNA？事实上，两种非编码 RNA（ncRNA）的另一种共有属性还未被广泛发现，那就是「编码」！
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课程时间：4 月 14 日 15:30
课程内容：
1. 如何获得 circRNA 并坚定其存在；
2. 如何进行 circRNA 上下调及设计方法；
3. 解析 circRNA 三大功能机制的特点及研究方法；
4. 盘点 circRNA 研究中常用数据库。
01
非编码 RNA「编码」概况
根据许多标准，非编码 RNA 不太可能编码功能蛋白。这些标准包括缺乏长的 ORF，缺乏氨基酸序列保守性和缺乏已知的蛋白质结构域1。由于技术手段受限，长久以来，人们忽视了这些分子编码的短肽对生命活动的影响。
得益于分子技术的发展，Orera2 等分析了六种生物的核糖体谱数据，发现 lncRNA 与核糖体关联达到 30~82%（编码为 >92%），预示着 lncRNA 存在较大的编码潜力；如人 MRI-2（69 个氨基酸）刺激 DNA 双链断裂连接3；人 lncRNA-HOXB-AS3 可编码长约 53 位氨基酸的短肽，该短肽而非 lncRNA 可抑制结肠癌的发生4。
环状 RNA（circRNA），同样具有编码短肽的功能。其翻译特性由 m6A 或者 IRES（招募核糖体功能）驱动。Circ-FBXW7 表达 185aa 的短肽与胶质母细胞瘤表型相关5；circ-SHPRH 表达 146aa 的短肽可起到抑制胶质瘤的发生6；circ-ZNF609 编码的短肽可控制成肌细胞的增殖7。
一系列的报道预示着，sORFs 是一片蓝海有待发掘。那么，如何研究 ncRNA 的编码特性呢？我们以 HOXB-AS3（NCBI 登录号 NR_033201）为例为您详解 lncRNA-sORF 的预测及实验设计过程。
02
lncRNA-sORF 预测
1
ORF 预测
大部分 lncRNA 编码的肽段较短、或者一条长链里面包含多个 ORF，优先选择 ORF 较长的研究。打开 orffinder 预测网站，输入登录号 ID 或者序列，其他参数默认（参考已发现最小的短肽，目前预测短肽的最小值是 24aa），点击「submit」，可看到两条预测结果：
注意只看「strand」为「+」的结果，因为 RNA 是单链的，编码区不会存在负义链上。网站预测到 HOXB-AS3 存在两个短肽，分别为 53、40 个氨基酸，接下来就是进行实验验证。
2
实验设计
针对预测的短肽是否编码，常规是构建过表达载体并在 ORF 的 C 端添加标签 (荧光或者 WB 标签)，并需要将翻译起始位点 ATG 进行突变，以确认翻译的起始位点。具体操作如下：
方法一：针对较长的肽，可采取融合 flag 直接进行 WB，直接将 flag 插入在全长 lncRNA 的 ORF 末端，并设计 ATG 突变作为对照（文章还设计了只构建编码区作为阳参），随后进行 WB 实验即可。
方法二：针对短肽，若 WB 灵敏度不足以检测到，那么采取短肽融合荧光策略较优。方法类似，后续通过荧光的表达即可确认肽是否编码。
03
circRNA 预测
得益于 circRNADb 数据库对收录的 circRNA 进行了较多的注释，circRNA 可以直接查询网站统计好的预测数据。以 FBXW7（hsa_circ_0001451）为例，直接在 circrnadb 数据库查找 FBXW7 名称，找到对应的 circRNA（在 circrnadb 的 ID 是 hsa_circ_16502），可以获得数据库预测的 IRES（也可以用 IRESfinder 预测）以及 ORF 区（同样可以用 ORFfinder 预测，但是要将序列成环延伸变为线性再进行预测）：
接下来仿照 lncRNA 的做法，在 ORF 末端加上标签，进行密码子 ATG 突变，以及 IRES 缺失构建环状 RNA 过表达，进行表达验证：
非编码 RNA 通常转录活性较低，且由于较短的 ORF，同于早前认为 lncRNA 是转录垃圾，一些科研人员认为大部分短肽是无功能的翻译垃圾。然而研究发现：多数人类特异性编码基因是从猕猴或黑猩猩低表达的非编码 RNA 进化而来8，这表示在选择压力下，ncRNA 编码的肽可作为物种进化时新肽的重要来源2，至于 ncRNA 表达的肽是否具有更加广泛的生物学意义，还待更多的科学研究！！！
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小助手丁香通通
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【参考文献】
1.GENCODE: the reference human genome annotation for The ENCODE Project；
2.Long non-coding RNAs as a source of new peptides；
3.A human short open reading frame (sORF)-encoded polypeptide that stimulates DNA end joining；
4.A Peptide Encoded by a Putative lncRNA HOXB-AS3 Suppresses Colon Cancer Growth；
5.Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis；
6.A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis；
7.Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis；
8.Hominoid-Specific De Novo Protein-Coding Genes Originating from Long Non-Coding RNAs.
文章来源：吉凯基因
图片来源：参考文献
题图来源：站酷海洛
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