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突破认知:LncRNA、circRNA 编码啦!

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生物学霸 2021-04-10 19:22

提到 lncRNA、circRNA,大家最先想到的研究热点是什么?lncRNA 的 cis、trans?还是 circRNA 的 ceRNA?事实上,两种非编码 RNA(ncRNA)的另一种共有属性还未被广泛发现,那就是「编码」!

如果你想对环状 RNA 研究有更多的了解,Get 更多的研究技巧,那下面这个免费课程非常适合你!

课程时间:4 月 14 日 15:30

课程内容:

1. 如何获得 circRNA 并坚定其存在;

2. 如何进行 circRNA 上下调及设计方法;

3. 解析 circRNA 三大功能机制的特点及研究方法;

4. 盘点 circRNA 研究中常用数据库。

01

非编码 RNA「编码」概况

根据许多标准,非编码 RNA 不太可能编码功能蛋白。这些标准包括缺乏长的 ORF,缺乏氨基酸序列保守性和缺乏已知的蛋白质结构域1。由于技术手段受限,长久以来,人们忽视了这些分子编码的短肽对生命活动的影响。

得益于分子技术的发展,Orera2 等分析了六种生物的核糖体谱数据,发现 lncRNA 与核糖体关联达到 30~82%(编码为 >92%),预示着 lncRNA 存在较大的编码潜力;如人 MRI-2(69 个氨基酸)刺激 DNA 双链断裂连接3;人 lncRNA-HOXB-AS3 可编码长约 53 位氨基酸的短肽,该短肽而非 lncRNA 可抑制结肠癌的发生4。

环状 RNA(circRNA),同样具有编码短肽的功能。其翻译特性由 m6A 或者 IRES(招募核糖体功能)驱动。Circ-FBXW7 表达 185aa 的短肽与胶质母细胞瘤表型相关5;circ-SHPRH 表达 146aa 的短肽可起到抑制胶质瘤的发生6;circ-ZNF609 编码的短肽可控制成肌细胞的增殖7。

一系列的报道预示着,sORFs 是一片蓝海有待发掘。那么,如何研究 ncRNA 的编码特性呢?我们以 HOXB-AS3(NCBI 登录号 NR_033201)为例为您详解 lncRNA-sORF 的预测及实验设计过程。

02

lncRNA-sORF 预测

1

ORF 预测

大部分 lncRNA 编码的肽段较短、或者一条长链里面包含多个 ORF,优先选择 ORF 较长的研究。打开 orffinder 预测网站,输入登录号 ID 或者序列,其他参数默认(参考已发现最小的短肽,目前预测短肽的最小值是 24aa),点击「submit」,可看到两条预测结果:

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注意只看「strand」为「+」的结果,因为 RNA 是单链的,编码区不会存在负义链上。网站预测到 HOXB-AS3 存在两个短肽,分别为 53、40 个氨基酸,接下来就是进行实验验证。

2

实验设计

针对预测的短肽是否编码,常规是构建过表达载体并在 ORF 的 C 端添加标签 (荧光或者 WB 标签),并需要将翻译起始位点 ATG 进行突变,以确认翻译的起始位点。具体操作如下:

方法一:针对较长的肽,可采取融合 flag 直接进行 WB,直接将 flag 插入在全长 lncRNA 的 ORF 末端,并设计 ATG 突变作为对照(文章还设计了只构建编码区作为阳参),随后进行 WB 实验即可。

方法二:针对短肽,若 WB 灵敏度不足以检测到,那么采取短肽融合荧光策略较优。方法类似,后续通过荧光的表达即可确认肽是否编码。

03

circRNA 预测

得益于 circRNADb 数据库对收录的 circRNA 进行了较多的注释,circRNA 可以直接查询网站统计好的预测数据。以 FBXW7(hsa_circ_0001451)为例,直接在 circrnadb 数据库查找 FBXW7 名称,找到对应的 circRNA(在 circrnadb 的 ID 是 hsa_circ_16502),可以获得数据库预测的 IRES(也可以用 IRESfinder 预测)以及 ORF 区(同样可以用 ORFfinder 预测,但是要将序列成环延伸变为线性再进行预测):

接下来仿照 lncRNA 的做法,在 ORF 末端加上标签,进行密码子 ATG 突变,以及 IRES 缺失构建环状 RNA 过表达,进行表达验证:

非编码 RNA 通常转录活性较低,且由于较短的 ORF,同于早前认为 lncRNA 是转录垃圾,一些科研人员认为大部分短肽是无功能的翻译垃圾。然而研究发现:多数人类特异性编码基因是从猕猴或黑猩猩低表达的非编码 RNA 进化而来8,这表示在选择压力下,ncRNA 编码的肽可作为物种进化时新肽的重要来源2,至于 ncRNA 表达的肽是否具有更加广泛的生物学意义,还待更多的科学研究!!!

经过一番介绍大家是不是对环状 RNA 有了更多认识,不如现在就来学习,Get 更多实用技能,解决实验过程中遇到的各种阻碍,一路打怪升级,加速科研进展!为此我们特意准备了环状 RNA 研究和实验的免费课程,现在报名学习,研究快人一步。

小助手丁香通通

(dingxiangtonghuo)

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【参考文献】

1.GENCODE: the reference human genome annotation for The ENCODE Project;

2.Long non-coding RNAs as a source of new peptides;

3.A human short open reading frame (sORF)-encoded polypeptide that stimulates DNA end joining;

4.A Peptide Encoded by a Putative lncRNA HOXB-AS3 Suppresses Colon Cancer Growth;

5.Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis;

6.A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis;

7.Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis;

8.Hominoid-Specific De Novo Protein-Coding Genes Originating from Long Non-Coding RNAs.

文章来源:吉凯基因

图片来源:参考文献

题图来源:站酷海洛

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